野生酸棗黃酮乙醇提取工藝研究

李富強(qiáng)，壽晨莉，張悅瑤，程文璇，王夢(mèng)姣，張 玲，張東芹，王報(bào)貴

(濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院&山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心&濱州市食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256603)

1 引言

酸棗(ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge)Hu ex H .F. Chow)，鼠李科棗屬植物，原產(chǎn)于長(zhǎng)江以北的華北地區(qū)，中南地區(qū)也有分布，目前在全世界范圍內(nèi)種植，分布甚廣，產(chǎn)量頗豐[1]。野生酸棗作為平性類植物之一，其所包含的黃酮類化合物具有安神、改善神經(jīng)系統(tǒng)的藥用價(jià)值，是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，可有效中和體內(nèi)的氧自由基，從而起到延緩細(xì)胞衰老、老化；也可以改善血液循環(huán)，降低膽固醇，從而大大降低心血管疾病的病發(fā)率[2]。

黃酮類化合物在藥理、生物活性方面也有良好的活性，首先其有助于將炎性生物酶保留在體內(nèi)，從而加快傷口的愈合速度，還有止痛的效果；其次因?yàn)榫哂袕?qiáng)抗組織胺的特性，所以可用來(lái)治療多種敏感性疾病[3]。有研究發(fā)現(xiàn)蚊子草中的部分黃酮提取物對(duì)NO、IL-6炎癥因子的釋放有顯著的抑制作用，具有明顯的抗炎活性。此外，相比于不喝綠茶的人，時(shí)常喝綠茶的人患心臟病的概率小了約1/2，致命性的更是僅有前者的1/3；其中重要的原因之一就是綠茶中所含的黃酮[4]。除此之外，黃酮在降低血糖、血壓方面也具有極佳的效果，有相關(guān)結(jié)論表明，植物黃酮提取物均有不同程度降低血糖的能力，降低血清TC水平，升高SOD等水平，且其降低血糖能力與總黃酮含量有明顯的正相關(guān)關(guān)系；同時(shí)其對(duì)血液流變學(xué)的相關(guān)指標(biāo)也有不同程度的改善作用[5]。黃酮類化合物具有極強(qiáng)的抗氧化性，主要表現(xiàn)在它基于獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)能夠減少自由基的生成同時(shí)具有中和自由基的能力，且黃酮中羥基的數(shù)量越多，其質(zhì)子所具有的能力就更強(qiáng)，也就會(huì)提高其對(duì)氧化效果的對(duì)抗作用。研究表明：在新鮮果蔬中，如部分蔬菜類的黃酮提取物對(duì)Fe3+有不低的中和作用以及極高的中和DPPH等類似自由基的活性，且其中和強(qiáng)度在活性物質(zhì)提高的情況下也會(huì)有相應(yīng)的提高[6]。也有其他結(jié)論表明，黑果枸杞當(dāng)中的黃銅提取物其在抗氧化能力方面已經(jīng)明顯優(yōu)于抗壞血酸[7]。

目前發(fā)現(xiàn)，酸棗當(dāng)中具有黃酮類物質(zhì)，但未被充分利用，部分提取工藝尚不夠完善[8，9]。因此本課題研究采用超聲輔助乙醇提取工藝提取野生酸棗中黃酮的最佳提取工藝。總體目的是在單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)的模型下，找出最優(yōu)的提取工藝參數(shù)如時(shí)間、溫度、料液比等，以期由此獲得最好的提取方式，將會(huì)對(duì)酸棗中黃酮的利用最大化，為酸棗的綜合利用提供一種切實(shí)可行的工藝，對(duì)未來(lái)對(duì)酸棗的開(kāi)發(fā)和產(chǎn)業(yè)利用提供參考價(jià)值。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 主要儀器與試劑

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)，紅外干燥箱(上海景邁儀器設(shè)備有限公司)，海信(山東)冰箱， KQ-A1000DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，電子天平(上海菁海儀器有限公司)，JJ-2 組織搗碎機(jī)，酸棗(山西中晉元農(nóng)貿(mào)有限公司)，無(wú)水乙醇(煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司)，Rutin-蘆丁標(biāo)品(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)，硝酸鋁(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，亞硝酸鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，氫氧化鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品預(yù)處理

把清洗過(guò)的食品級(jí)酸棗去核處理，將果核上的果肉分離干凈，用剪刀將果肉及果皮部分剪成小塊狀，平鋪在清洗并烘干的托盤上，保持在45 ℃下，于紅外干燥箱中烘干至重量不變，取出后進(jìn)行粉碎處理，然后過(guò)40目篩，裝入密封袋中，保存于4 ℃冰箱中備用[10]。

2.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

首先配制0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液，并以其作為對(duì)照。步驟為：準(zhǔn)確稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(20.00 mg)，于恒溫(40 ℃)水浴下使用乙醇進(jìn)行溶解，而后在室溫下定容于50 mL的燒杯中、震蕩搖勻后備用。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液用5 mL的移液管分別吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL至預(yù)先準(zhǔn)備好的25 mL具塞試管中，同時(shí)做一組空白對(duì)照，首先加入配制好的濃度為5%的亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min，接著加入濃度為10%的硝酸鋁溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min，再加入濃度為4%的氫氧化鈉溶液7.5 mL，最后用相同濃度的乙醇濃度定容至25 mL，搖勻靜置15 min[9]。以0 mL母液的對(duì)照組為參照，用紫外分光光度計(jì)的510nm處，測(cè)定各樣品的OD值，每樣平行測(cè)定3次取平均值，用每組樣品計(jì)算出的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液濃度(x)為橫軸，OD值(y)為縱軸繪制蘆丁標(biāo)曲。

2.2.3 黃銅的提取

準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品酸棗粉，放置于50 mL離心管中，加入相對(duì)應(yīng)濃度和體積的浸取液乙醇，搖勻，使酸棗粉和乙醇溶液充分混勻，在適當(dāng)?shù)某暪β氏绿崛∫欢〞r(shí)間的黃酮。將提取液置于高速冷凍離心機(jī)中，在4200 r/min條件下離心20 min后，取上清液并添加相應(yīng)濃度提取液至體積相同，靜置備用。

2.2.4 黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)-NaOH光度法檢測(cè)總黃酮含量[8]。用1000 L移液槍吸取1mL備用樣液于離心管中，再依次用相同規(guī)格移液槍精確添加NaNO2溶液、Al(NO3)溶液和NaOH溶液各0.4 mL，注意每次添加后均需進(jìn)行震蕩加靜置步驟，時(shí)長(zhǎng)分別為6 min、6 min和15 min，而后測(cè)定其OD510nm值，依照前一步繪制的蘆丁曲線和公式(1)得出黃酮總量：

(1)

式(1)中：c為由蘆丁標(biāo)曲對(duì)應(yīng)算出定容后待測(cè)樣液中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；v為樣液的總體積，mL；m為野生酸棗粉質(zhì)量，mg。

2.3.5 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)水平見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)水平

2.2.6 數(shù)據(jù)處理

各單因素及標(biāo)曲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在Word整理，查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定各因素實(shí)驗(yàn)初步范圍，確定單因素水平表，收集標(biāo)曲和各單因素平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在Prism中繪制折線圖；參照單因素結(jié)果確定正交試驗(yàn)因素水平表，在SPSSAU網(wǎng)頁(yè)中制作正交表；記錄正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析得出總黃酮得率最高的組合。

3 結(jié)果與討論

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可以得出，蘆丁標(biāo)曲回歸方程為：y=12.889x-0.0003，R2=0.9991，線性關(guān)系較好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響結(jié)果

從圖2可以發(fā)現(xiàn)，在提取劑濃度較低時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與總黃酮提取率成正相關(guān)，即隨著體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，總黃酮提取率也逐漸升高，并在濃度為55%時(shí)達(dá)到峰值，但是，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大，總黃酮提取率開(kāi)始降低。出現(xiàn)這種曲線出現(xiàn)可能是55%乙醇的極性與酸棗粉中提取物的極性相差較小，所以，這種溶質(zhì)與溶劑結(jié)構(gòu)上的相似，導(dǎo)致提取物與提取液彼此互溶達(dá)到最大，也就表現(xiàn)為黃酮得率最高。因此乙醇濃度為55%是最適的提取濃度，并用于后續(xù)單因素試驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對(duì)得率的影響

3.2.2 液固比對(duì)總黃酮得率的影響結(jié)果

由圖3可知，當(dāng)液固比處于5∶1至25∶1之間時(shí)，液體含量與黃酮得率成正比，即液體含量越多，黃銅得率就越大，并且液固比為25∶1所得率達(dá)到峰值(1.243%)，而當(dāng)液固比升高到30∶1(mL/g)時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。由此可說(shuō)明當(dāng)浸取的體積液過(guò)低時(shí)，無(wú)法將樣品當(dāng)中的黃酮全部浸取出來(lái)，不能徹底溶出黃酮，因此隨著浸取液的增多，浸取液更完全的浸取黃酮，當(dāng)浸取液足夠多時(shí)，酸棗粉當(dāng)中絕大部分的黃酮能夠被浸取，黃酮得率達(dá)到最高，當(dāng)浸取液的用量繼續(xù)增加時(shí)，可能會(huì)浸取出部分會(huì)影響黃酮顯色反應(yīng)及吸光度測(cè)定的雜質(zhì)，或者會(huì)使部分黃酮發(fā)生變性，并且加入過(guò)量的浸取液會(huì)造成試劑的浪費(fèi)，綜上考慮，最佳液固比為25∶1(mL/g)，并用于后續(xù)單因素試驗(yàn)。

圖3 液固比對(duì)得率的影響

3.2.3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

由圖4可知，超聲時(shí)間處于20～40 min時(shí)，總黃酮得率與時(shí)長(zhǎng)成正比，即時(shí)間越長(zhǎng)，得率越大，直至40 min時(shí)到達(dá)峰值；隨后，超聲時(shí)間的延長(zhǎng)致使總黃酮得率出現(xiàn)較大幅度降低。這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)時(shí)間短于20 min時(shí)，酸棗中黃酮浸取未達(dá)到飽和，得率較低；隨著時(shí)間增加，黃酮化合物有充足的時(shí)間析出，得率隨之上升。但當(dāng)時(shí)間超過(guò)40 min之后，浸取液在較高溫度下部分揮發(fā)，導(dǎo)致?lián)p失使得率下降；同時(shí)，較長(zhǎng)時(shí)間處于較高溫度下，黃酮類物質(zhì)也容易被分解破壞，或者發(fā)揮抗氧化性而被分解，引入其它雜質(zhì)，使得率下降。因此，全面考慮確定最佳超聲時(shí)間為40 min，并用于后續(xù)單因素試驗(yàn)。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響

3.2.4 超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響

由圖5可以看出，在40 ℃之前，隨著超聲溫度的逐漸升高，總黃酮得率急劇升高，并在40 ℃時(shí)總黃酮的得率達(dá)到峰值，隨后其隨著超聲溫度的增加呈逐漸下降趨勢(shì)。造成這種趨勢(shì)的原因可能為，在40 ℃之前，溫度對(duì)黃酮化合物的溶出起主導(dǎo)影響，隨著超聲溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)速度加快，混合溶液的粘性降低，使得浸取效率較高，當(dāng)溫度升高到30～50 ℃時(shí)，總黃酮的得率較為穩(wěn)定，表明酸棗當(dāng)中黃酮在這段溫度區(qū)間較為穩(wěn)定，浸取率較高且沒(méi)有被大量破壞；當(dāng)隨著溫度繼續(xù)升高至50 ℃之后，表明溫度對(duì)黃酮的黃酮類化合物的破壞作用已經(jīng)較為嚴(yán)重，此時(shí)析出雜質(zhì)的量也較高，使得率出現(xiàn)較大幅度的下降趨勢(shì)。此外，綜合考慮溫度過(guò)高耗能和對(duì)浸取液揮發(fā)這一重要影響因素，確定最佳的超聲溫度為40 ℃，并用于后續(xù)單因素試驗(yàn)。

3.2.5 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響

由圖6可以看出，400～500 W總黃酮得率隨著超聲功率的升高出現(xiàn)緩慢的上升趨勢(shì)，并在500 W超聲功率達(dá)峰值，隨后其隨著超聲功率的升高得率出現(xiàn)緩慢降低的趨勢(shì)。出現(xiàn)這種趨勢(shì)是因?yàn)椋贸暡ㄝ椛鋲簭?qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級(jí)效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速黃酮類化合物進(jìn)入乙醇溶液，以此提高總黃酮得率。但隨著超聲功率的升高，總黃酮得率下降可能使其他雜質(zhì)物質(zhì)析出，影響黃酮化合物的溶出，確定最佳功率為500 W。

圖5 超聲溫度對(duì)得率的影響

圖6 超聲功率對(duì)得率的影響

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

參照3.2單因素試驗(yàn)所得出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析情況，選取對(duì)酸棗果肉及果皮黃酮得率影響作用更顯著的因素(即乙醇濃度、液固比、超聲溫度和時(shí)間)，繼續(xù)進(jìn)行了正交試驗(yàn)，以優(yōu)化超聲波輔助浸取酸棗果皮和果肉中總黃酮的工藝參數(shù)，因超聲功率影響較小，故綜合耗能考慮選擇超聲功率400 W，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在試驗(yàn)5中酸棗粉黃酮的得率達(dá)到最大值，最優(yōu)組合為A2B2C3D1，此時(shí)酸棗果肉及果皮中黃酮得率可達(dá)1.447%。通過(guò)比較R值可以發(fā)現(xiàn)，各因素的影響程度順序?yàn)锳-乙醇濃度最顯著，C-液固比較明顯，D-超聲溫度次次，D-超聲時(shí)間最弱，據(jù)此得到最佳提取因素是：乙醇濃度55%；超聲時(shí)間40 min；液固比27∶1 (mL/g)；超聲時(shí)間35 ℃；超聲功率400 W。

4 結(jié)論

本研究先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，來(lái)探究乙醇濃度、液固比及超聲溫度、時(shí)間和功率對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果表明超聲功率的影響最小，綜合考慮耗能因素選取400 W為最佳功率。而后，進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)分析另4種因素，得以確定酸棗果肉及果皮中黃酮的最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度55%；超聲時(shí)間40 min；液固比 (mL/g) 27∶1；超聲時(shí)間35 ℃；超聲功率400 W。此時(shí)的酸棗果肉及果皮黃酮的浸取率為1.477%，相比于其他條件屬最高且綜合能耗較低，既滿足使用要求，也符合經(jīng)濟(jì)效益；整體試驗(yàn)結(jié)果還表明酸棗果肉及果皮中有較多黃酮含量，具有很好的利用價(jià)值，本研究工藝很大程度上能促進(jìn)酸棗資源的綜合開(kāi)發(fā)和產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)。