非洲豬瘟病毒LNA引物PCR檢測方法的建立及優化

李 艷，張煜軒，楚品品，蔣智勇，席振軍，蔡汝健，勾紅潮，張昆麗，宋 帥，卞志標，李春玲

（廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州 510640）

0 引言

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性和高度致死性傳染病，病死率可達100%[1]。2018年8月3日，非洲豬瘟疫情在中國沈陽市沈北新區首次被發現[2]，隨后在全國各地陸續爆發，給中國養豬業帶來了毀滅性的打擊，造成了前所未有的經濟損失[3]。世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定報告疫病，中國將其列為一類動物疫病。目前非洲豬瘟尚無有效疫苗，現階段該病的防控重點仍然是早發現、早剔除進而有效預防和控制疫情，因此建立ASFV快速、特異的檢測方法對ASF防控具有重要意義。

ASFV是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，是一種大型囊膜病毒，基因組由單分子線性、共價閉合的雙鏈DNA組成，大小為170～190 kb，編碼151～167個開放閱讀框[4-5]。ASFV粒子結構復雜而規則，包含50多種結構蛋白，呈現二十面體對稱結構，病毒粒子直徑約為200 nm[6]。P72蛋白是ASFV的主要結構蛋白，由基因B646L編碼，該基因高度保守，是目前ASFV檢測中常用的引物設計靶標[7]。

PCR方法是目前ASFV快速診斷中廣泛推薦使用的核酸檢測技術[8]，賈云飛等[9]針對非洲豬瘟病毒p72基因建立了非洲豬瘟病毒SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法，崔貝貝等[10]基于E184L基因建立了非洲豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測方法。熒光定量PCR方法檢測靈敏度高、特異性強，但所用儀器和試劑價格昂貴，成本高，且對操作人員要求嚴格，不利于其在條件一般的實驗室或基層獸醫臨床檢測中大規模推廣應用；常規PCR方法操作簡單、成本低，但其敏感性和特異性有待進一步提高。鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)技術通過將堿基進行鎖核酸修飾，可顯著提高核苷酸與DNA模板的結合能力，含有LNA堿基的引物可顯著提高PCR擴增的特異性和敏感性，Tm值顯著提高。研究報道顯示，在病原檢測[11-13]、病原鑒別檢測[14]及基因突變[15]等方面已廣泛應用LNA技術對引物及探針進行修飾，獲得了良好的檢測效果。Zhang等[13]通過LNA修飾引物，建立了百日咳桿菌的LNA-OTN-q-PCR方法，方法的靈敏度較常規RT-PCR方法提高了100倍。也有研究者通過鎖核酸修飾探針，建立了人類B型肝炎病毒(HBV)的LNA探針實時熒光定量PCR檢測方法，其靈敏度、穩定性及擴增效率均顯著高于TaqMan探針法[16]。目前尚未見非洲豬瘟病毒LNA修飾引物PCR檢測方法的研究報道。

本研究根據ASFV基因組p72基因設計特異性引物，并將引物堿基進行選擇性LNA修飾，建立了非洲豬瘟病毒的LNA引物PCR檢測方法，為非洲豬瘟防控提供了新的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病毒均采購自市場上的商品化疫苗，其中，豬瘟病毒活疫苗購自廣東永順生物制藥股份有限公司，豬偽狂犬病毒活疫苗（Bartha-K61株）、豬圓環病毒2型滅活疫苗購自上海海利生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 EmeralAmp Max PCR Master(2×)，TB Green Premix Ex TaqⅡ(2×)，DL500 DNA Marker均購自寶生物工程大連有限公司；DNA提取試劑盒購自Magen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank公布的非洲豬瘟病毒的基因組序列中保守穩定的B646L基因（P72蛋白基因，登錄號：MH713612）序列，設計兩對特異性引物，同時對引物序列中適當的堿基進行鎖核酸修飾，引物具體序列如表1所示。

表1 引物信息

1.2.2 標準品的制備 陽性重組質粒pUC57-ASFV-p72由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。測序結果與GenBank序列比對無誤后，采用全自動紫外分光光度計測定質粒的濃度和純度。

1.2.3 LNA引物PCR方法的建立 LNA引物PCR預設反應體系：EmeralAmp Max PCR Master(2×)10 uL，上、下游引物(10 umol/L)各1.0 uL，模板1.0 uL，加雙蒸水至20 uL。PCR預設反應條件：95℃、4 min；94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、40 s，35個循環；72℃、10 min。退火溫度的優化，在LNA引物PCR反應中，設置退火溫度為60～75℃。反應結束后，取5 uL PCR產物用3.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。引物濃度優化，將上、下游引物濃度范圍設置為0.1～0.7 umol/L，以0.1 umol/L遞增，進行PCR擴增。反應結束后，取5 uL PCR產物用3.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 常規引物PCR方法的反應體系和反應條件 反應體系：EmeralAmp Max PCR Master(2×)10 uL，上、下游引物(10 umol/L)各0.8 uL，模板1 uL，加雙蒸水至20 uL。反應條件：95℃、4 min；94℃、30 s，65℃、30 s，72℃、40 s，35個循環；72℃、10 min。

1.2.5 熒光定量PCR方法的反應體系及反應條件 采用P1/P2引物，按照反應體系：TB Green Premix Ex TaqⅡ(2×)10 uL，上、下游引物各0.8 uL，模板1 uL，加雙蒸水至20 uL。擴增程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環；溶解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，進行real-time PCR擴增。

1.2.6 LNA引物PCR方法的靈敏性檢測 將測定濃度和純度后的陽性重組質粒pUC57-ASFV-p72分別做10倍的梯度稀釋，選取3×106～3×100copies/uL共7個稀釋度的重組質粒作為標準品模板，選取3×105～3×100copies/uL共6個稀釋度的重組質粒，使用優化后的LNA引物PCR條件，進行LNA引物PCR及常規PCR擴增，并進行兩者的敏感性比較，試驗重復3次；選取3×106～3×101copies/uL共7個稀釋度的重組質粒使用優化后的LNA引物PCR條件及常規引物real-time PCR條件，進行LNA引物PCR及常規引物real-time PCR，進行兩者的敏感性比較，試驗重復3次。

1.2.7 LNA引物PCR方法的特異性檢測 利用所建立的LNA引物PCR反應體系和反應參數，以3×105拷貝的陽性重組質粒作為標準的陽性對照。豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病毒基因組作為模板，無菌水作為陰性對照，進行LNA引物PCR，以驗證方法的特異性。

1.2.8 LNA引物PCR方法的應用 用本研究建立的LNA引物PCR方法對72份臨床采集的豬的組織樣品進行檢測，并與OIE提供的實時熒光定量PCR方法進行比對。

2 結果與分析

2.1 LNA引物PCR反應條件優化

退火溫度優化結果顯示，LNA引物退火溫度范圍廣，在60～75℃退火溫度范圍內均有較好的擴增，退火溫度為70.3時，擴增效果最佳（圖1A），因此LNA引物PCR反應退火溫度選擇70.3℃。而常規引物僅在60～68.4℃退火溫度范圍內有較好擴增，退火溫度高于68.4℃時，擴增條帶越來越弱（圖1B）。LNA引物濃度優化結果顯示，隨著引物濃度提高，擴增目的條帶越來越亮，當上、下游引物濃度為0.4 μmol/L(0.8 uL)時，擴增條帶最明顯，而后隨著引物濃度升高擴增條帶無明顯變化，因此最佳引物濃度為0.4 μmol/L（圖2）。基于退火溫度和引物濃度優化結果，建立了最佳反應體系如下：EmeralAmp Max PCR Master(2×)10 uL，上、下游引物(10 umol/L)各0.8 uL，模板1 uL，加雙蒸水至20 uL。反應條件：95℃、4 min；94℃、30 s，70.3℃、30 s，72℃、40 s，35個循環；72℃、10 min。

圖1 不同退火溫度的擴增結果

圖2 引物濃度的優化

2.2 LNA引物PCR的敏感性

敏感性試驗結果顯示，LNA引物PCR最低檢測限為3×101copies/uL（圖3），常規引物PCR檢測限為3×103copies/uL（圖4），常規引物real-time PCR最低檢測限度為3×102copies/uL（圖5），LNA引物PCR較常規引物PCR敏感性提高100倍，LNA引物PCR比常規引物real-time PCR敏感性高10倍。

圖3 LNA引物PCR敏感性

圖4 常規引物PCR敏感性

圖5 Real-time PCR敏感性實驗結果

2.3 LNA引物PCR的特異性

采用P3/P4引物分別對3×105拷貝的陽性重組質粒、豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病毒基因組進行LNA引物PCR，結果只有陽性重組質粒能擴增出147 bp的目的片段，其它病毒未擴增出條帶，如圖6所示，試驗表明LNA引物PCR檢測方法具有良好的特異性。

圖6 特異性試驗結果

2.4 LNA引物PCR方法的應用

應用本研究建立的LNA引物PCR方法對臨床樣品進行檢測，同時用OIE推薦的實時熒光定量PCR方法進行驗證[17]。結果顯示，72份樣品均未擴增出目的條帶，檢測結果為陰性，與OIE推薦的實時熒光定量PCR法檢測結果一致，符合率為100%（表2）。

表2 LNA引物PCR和OIE推薦real-time PCR方法檢測結果比對

3 討論

中國是世界第一養豬大國，任何危害養豬業發展的新發疾病都必須引起高度重視。非洲豬瘟作為目前嚴重危害中國養豬業發展的新發疾病，給養豬業帶來前所未有的經濟損失和防控挑戰[18]，目前該病尚無有效疫苗，防控主要依靠早期診斷，精準剔除，因此針對病的診斷技術研究是科研工作者目前的研究方向之一。

目前已有多種非洲豬瘟病毒核酸檢測方法的研究報道，主要有熒光定量PCR[19-20]、數字PCR[21-22]、實時熒光LAMP[23-24]及納米孔測序[25]等，這些檢測方法雖然檢測效果理想，但普遍存在設備昂貴、成本高、操作繁瑣等實際問題，較難在基層大規模推廣應用。

PCR檢測方法是OIE官方推薦的ASFV檢測方法，也是最適合基層及實驗條件一般的實驗室采用的ASFV檢測方法，但該方法在檢測ASFVp72基因Ⅱ型毒株的實驗樣品時，敏感性較低[26]，這將嚴重影響ASFV檢測的準確性，進而延誤非洲豬瘟疫情的防控。PCR檢測中引物的設計至關重要，直接影響檢測效果，有研究者通過重新設計引物建立了新的非洲豬瘟病毒的PCR檢測方法，方法的檢測靈敏度達60個拷貝數[27]。研究顯示對引物序列進行堿基修飾，可增加引物序列和靶基因序列的親和力，從而有效提高PCR方法的檢測效果。

LNA是一種雙環狀核酸衍生物，核糖的2'-O位和4'-C位通過縮水作用形成氧亞甲基橋并連接成鎖狀結構，該結構鎖定了呋喃糖C3內型的N構型，降低了核糖結構柔韌性，同時增加了磷酸鹽骨架的穩定性，使PCR反應中其與DNA、RNA結合成的雙鏈的穩定性和親和力更高[28]。最新研究報道顯示，該技術在乙型肝炎病毒基因突變[29]及狐貍、水貂成分快速檢測[30]中展現了較高的檢測靈敏度和特異性。近幾年筆者持續開展了LNA技術在豬病病原檢測中的應用，前期應用LNA技術進行探針修飾建立了豬偽狂犬病毒的LNA探針熒光定量PCR方法，方法的特異性和敏感性均較好[31]。目前尚未見非洲豬瘟病毒PCR檢測中引物進行LNA修飾的研究報道。本研究基于鎖核酸修飾堿基技術對ASFV檢測引物堿基進行了適當的LNA修飾，建立了ASFV的LNA引物PCR檢測方法。引物濃度和退火溫度在PCR反應中發揮關鍵作用，最適引物濃度和退火溫度可顯著提高PCR檢測的準確性和靈敏度。本研究對實驗過程中的引物濃度和退火溫度進行了優化，確定了最佳引物濃度為0.4 μmol/L，最佳退火溫度為70.3℃。本研究建立的LNA引物PCR具有較高的靈敏度，最低檢測限為3×101copies/uL，比常規引物PCR方法的靈敏性提高100倍，比常規引物realtime PCR檢測靈敏度提高10倍。本研究建立的LNA引物PCR方法具有良好的特異性，對豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病毒等病原均無目的條帶擴增，常規引物PCR在擴增過程中存在非特異性擴增現象，但LNA修飾后的引物在ASFV的擴增中無任何非特異性條帶出現，特異性良好。實驗結果表明，在非洲豬瘟PCR檢測中應用LNA進行引物堿基修飾可顯著提高PCR檢測方法的特異性和靈敏度該，本研究建立的LNA引物PCR方法可用于臨床非洲豬瘟病毒檢測，將在ASFV流行病學調查、監測及防控中發揮重要作用。

4 結論

本研究利用鎖核酸進行引物修飾，通過優化退火溫度及引物濃度，得到了非洲豬瘟病毒鎖核酸引物PCR反應體系最佳退火溫度為70.3℃，最佳引物濃度上、下游引物濃度分別為0.4 μmol/L，首次建立了非洲豬瘟病毒鎖核酸修飾引物PCR檢測方法。該方法的檢測靈敏度可達3×101copies/uL，遠遠高于常規引物PCR檢測靈敏度(3×103copies/uL)。方法特異性良好，與CSFV、PCV-2、PRV等病原無交叉反應。本研究為非洲豬瘟病毒臨床檢測提供了一種簡單、高效且便于推廣使用的新型檢測方法。