灑金柏色素變化及光合作用響應特征

廖 婷，付 琳，郭麗琴，劉國彬，王 燁，姚硯武，曹 均

（1北京市農林科學院林業果樹研究所，北京 100093；2內蒙古農業大學林學院，呼和浩特 010018）

0 引言

彩葉植物因其獨特和豐富的色彩變化在園林綠化中具有較高的觀賞價值，也是森林景觀的重要組成材料。從園林植物造景角度，根據葉色和觀賞期，可將彩葉植物分為春色葉植物、秋色葉植物、常色葉植物、雙色葉植物和斑色葉植物5類[1-3]。灑金柏(Plantycladus orientaliscv.Semperourescens)是柏科(Cupressaceae)側柏屬側柏(P.orientalis)的栽培變種，樹姿優美，樹冠外圍葉片一年四季呈現不同程度的黃色，基部葉片始終為綠色，觀賞期長，是重要的庭院、公園、景區常色葉觀賞樹種。探明其葉色動態變化的生理響應過程和機制對常色葉園林樹種的選育具有重要意義。

植物葉片呈色與體內色素組成種類、相對含量及在葉片中的分布和定位有關[4]；此外，外界環境因子，如光照強度、溫度等對色素合成和顯色有所影響[5-7]。葉片顏色發生變化最直接的原因是葉片中色素種類和比例的改變，對黃色葉植物來說，主要是葉綠素(Chl)和類胡蘿卜素(Car)的比例發生了變化，與Chl和Car的生物合成與降解過程有關[8-9]。通常對各類色素的研究，大多以花瓣為材料進行[10-12]。近年來，對秋色葉樹種在變色期的生理變化規律研究較多，如銀杏、槭樹、美國紅楓、楓香、金葉榆、櫟屬植物等，主要包括光合特性、色素含量、相關酶活性、內含物質含量、糖代謝等方面[13-15]，對常色葉樹種的生理動態變化規律的研究較為罕見。而葉片中色素分布于質體膜上，葉綠素是光合作用的關鍵色素，其含量影響凈光合作用，因此突變的黃色葉植株是研究葉綠體發育、葉綠素代謝、光合特性的理想材料。

基于此，本研究以灑金柏為研究材料，探究自然狀態下不同月份黃葉的色素變化過程及光合響應特征，揭示黃葉形成的原因和葉色動態變化規律。同時，以相同枝條上的綠色葉作為對照，消除遺傳背景不一致的影響。該研究可為灑金柏的遺傳育種工作提供參考依據，對園林植物常色葉品種選育和推廣具有重要的理論意義和實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用灑金柏種植于北京市農林科學院林業果樹研究所側柏資源圃內，位于北京市海淀區，樹齡20～30年，前期篩選出優良單株16株。灑金柏經過長期引種馴化，已經完全適應當地氣候，通過對灑金柏的生長、株型、葉色、抗性等性狀的長期觀測和研究，從16個優良單株中選擇頂部與基部葉片顏色差異最大的1株作為試驗材料。

生理指標測定和采樣時間為灑金柏葉片生長期，2018年3—10月，每個月取樣1次，分別從植株4個不同方向上采集新鮮葉片，迅速裝入凍存管，置于液氮中，隨后冷藏在-80℃的超低溫冰箱中，為后續試驗做準備。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉色測定 用英國皇家園林協會(RHS)植物比色卡分別對灑金柏黃葉和綠葉每月進行比色并記錄葉色變化，比色卡的顏色表達由數字和字母組成，前面的數字代表顏色，數值越大表示顏色越深；后面的字母則代表亮度，字母升序表示亮度越大。

1.2.2 色素含量測定 選取灑金柏不同時期頂部黃葉和基部綠葉進行相關色素含量測定，測定方法采用酒精萃取，具體參照蔡慶生植物生理學實驗中的方法[16]，用紫外可見分光光度計（型號UV-4802）測定波長665、649、470 nm下的吸光度，以95%乙醇作為空白對照，生物學重復3次。

葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、Chl、Car的計算見公式(1)～(4)。

參考孔祥生等[17]的方法測定類黃酮含量。制作蘆丁標準曲線后，以70%甲醇溶液作為提取劑，60%乙醇溶液作為空白對照，測定波長367 nm處的吸光度。

1.2.3 光合指標測定 光響應曲線測定：利用Li-6400便攜式光合儀對灑金柏黃葉和綠葉分別進行光響應曲線測定，設定光合有效輻射(PAR)為0、50、100、150、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600、2000 μmol/(m2·s)，CO2濃度為 400 μmol/mol，相對濕度 60%～65%，流速500 μmol/mol。

光合特性測定：在晴朗無風的天氣，上午8:30—11:30，使用Li-6400便攜式光合儀對灑金柏頂部黃葉和基部綠葉進行光合作用測定，儀器設定的參數為PAR=1400 μmol/(m2·s)，其余參數與光響應曲線參數一致。記錄的光合參數包括凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)、氣孔導度 (stomatal conductance,Gs)、胞間 CO2濃度(intercellular carbon dioxide concentration,Ci)和蒸騰速率(transpiration rate,Tr)。水分利用效率(water use efficiency,WUE)通過公式(5)計算得出[18]，每次測定包含3次生物學重復。

1.2.4 數據處理 運用SPSS 22軟件對所測定的指標進行單因素方差分析，采用鄧肯多重檢驗方法比較進行多重比較(α=0.05)，通過皮爾森相關系數分析各指標之間的相關性。利用Excel進行繪圖。

2 研究結果

2.1 灑金柏黃葉葉色變化

如圖1和表1可知，灑金柏頂部葉片在3—10月間葉色呈現出不同程度的黃色或者黃綠色的動態變化。3月份新葉開始萌發，枝梢頂部長出嫩黃色的葉片，隨著葉片的生長，枝梢頂部的葉色逐漸向黃綠色轉變，6、7、8月份葉片偏向黃綠色，9月后葉片又逐漸變為黃色，10月份葉片呈現濃郁的金黃色。而綠葉只在8月顏色略微變深，其余月份綠葉顏色差異不大。

表1 灑金柏黃葉和綠葉RHS葉色

圖1 3—10月灑金柏頂部黃葉葉色變化

2.2 灑金柏色素含量變化

如圖2A所示，灑金柏頂部黃葉Chl a含量始終低于基部綠葉，且差異顯著；黃葉與綠葉中Chl a含量的變化趨勢基本類似，即從3月開始呈上升趨勢，6—9月快速生長時期含量變化不大，僅綠葉Chl a含量在7月份有明顯下降，9月后呈現下降趨勢。黃葉和綠葉中Chl b含量變化趨勢與Chl a趨勢基本一致（圖2B）。在黃葉中，雖然有小幅度的變動，但并不顯著；在綠葉中，3月、4月含量顯著低于5—10月含量。黃葉與綠葉中的Chl含量變化趨勢與Chl a含量變化趨勢基本一致（圖2C），黃葉的Chl含量每個月均顯著低于綠葉，5—9月具有最高的Chl含量水平。

Car含量在3—4月份出現1個快速下降的階段，在黃葉中下降了51%，4—8月份雖平穩上升，但未達到顯著水平，8月份后開始大幅度上升（圖2D）。8月份，黃葉中Car含量為0.074 mg/g，10月達到0.168mg/g，上升幅度達56%。黃葉中Car含量在各個時期均低于綠葉中含量。

圖2 灑金柏3—10月葉色變化過程中色素含量

黃葉和綠葉中類黃酮含量變化趨勢基本一致，呈現平穩變化到迅速下降的過程（圖2E）。3—7月，黃葉中類黃酮含量顯著低于綠葉；7月后，黃葉中類黃酮含量呈平穩下降，而在綠葉中有1個迅速下降的過程。8—10月，兩種葉片中類黃酮含量無顯著差異。

雖然黃葉中各色素含量比綠葉中更低，但黃葉中類胡蘿卜素與總葉綠素(Car/Chl)含量比值高于綠葉（圖2F），6—9月無顯著差異。3月，黃葉與綠葉中Car/Chl含量比值差異最大，黃葉中達到最大值，為1，綠葉中比值為0.26。

2.3 灑金柏光合參數動態變化

圖3A為灑金柏黃葉和綠葉的光響應曲線。如圖所示，在PAR＜200 μmol/(m2·s)的低光照條件下，Pn對光合有效輻射的響應較為敏感，Pn在綠葉中的增加幅度比黃葉更大，隨后Pn在PAR為200～1200 μmol/(m2·s)范圍內平穩上升。當PAR＞1200 μmol/(m2·s)時，黃葉Pn趨于平穩，而綠葉Pn在PAR＞1400 μmol/(m2·s)時趨于平穩，之后隨PAR的增加而略微降低，表現出光抑制現象。在相同的PAR條件下，綠葉的Pn始終顯著高于黃葉。

根據光響應曲線的結果，選擇光飽和情況下(PAR=1400 μmol/(m2·s))測定黃葉和綠葉生長期不同月份的光合氣體交換參數。由圖3B可知，兩種葉片的Pn隨月份增加均呈現先升高后降低的趨勢，綠葉在8月出現最大值，為13.04 μmol/(m2·s)，黃葉在7—9月的Pn差異不顯著，最大值為11.11 μmol/(m2·s)；3—8月，灑金柏黃葉的Pn始終顯著低于綠葉，9—10月無顯著差異。

Gs整體表現出與Pn一致的趨勢（圖3C），黃葉在5月有1個降低的過程，綠葉在4月有1個降低的過程，8、9月，黃葉的Gs顯著高于綠葉。黃葉和綠葉均在8月份有最大的Gs值，分別為0.293 mol/(m2·s)和0.242 mol/(m2·s)。Ci的變化趨勢與Gs基本一致，隨著時間的增加呈現出先升高后降低的趨勢。但黃葉在4—5月有1個波動的變化過程（圖3D）。

由圖3E可知，Tr整體呈現先升高后降低的趨勢，黃葉Tr最大的月份為8月，達4.95 mmol/(m2·s)；綠葉7月份Tr最大，為4.04 mmol/(m2·s)。兩種葉片Tr在9—10月份無顯著差異。在整個生長季中，黃葉的WUE低于綠葉，3—8月變化趨勢較為平緩，只在5月時出現較大波動（圖3F）；8—10月，WUE隨時間而顯著升高。

圖3 灑金柏葉色變化過程中光合作用

2.4 灑金柏光合參數與色素含量相關性分析

由表2可知，黃葉與綠葉中，色素含量指標Chl a、Chl b、Chl之間呈極顯著正相關性，4個光合參數指標之間也呈顯著或極顯著正相關。黃葉中Gs和Tr的相關性最大，相關系數達0.917；其次是Pn和Gs，相關系數為0.82。Tr與WUE呈極顯著負相關關系，黃葉中相關系數為-0.559，綠葉的相關系數為-0.668，表明蒸騰作用越強，WUE越低。

表2 灑金柏色素含量與光合參數相關性

在黃葉中，Car/Chl與Chl a、Chl b、Chl含量之間呈極顯著負相關性，且相關系數均大于綠葉中的相關系數，表明黃葉受Car/Chl影響可能更大。此外，黃葉中Chl含量、Chl a含量與光合參數指標之間呈顯著正相關性，與Car/Chl呈顯著負相關性，相關系數大于綠葉中的相關系數，表明黃葉中光合作用受色素含量影響較大，綠葉光合作用除了受色素含量直接影響外，可能與其體內羧化酶活性有很大關系。

3 結論

本研究采用表型觀測與生理測定相結合方法研究了不同月份灑金柏葉色變化、葉片色素含量與光合作用的響應特征。結果表明，3月黃葉的Car/Chl含量比值達到最大值為1，此時綠葉的比值為0.26；黃葉的光合參數與Chl含量之間呈顯著正相關性，最大達0.86，而與Car/Chl含量比值呈顯著負相關性，達-0.68。表明灑金柏葉片呈現黃色是由于黃葉中Car/Chl含量比值較綠葉中更高導致。

4 討論

Chl、Car和花色苷等色素種類和比例的變化是彩葉植物葉色多變的直接原因。在灑金柏中，黃葉中的Chl a、Chl b、Chl、Car含量在3—10月均顯著低于綠葉中含量，呈顯著正相關關系；而黃葉中Car/Chl比值高于綠葉，且變化趨勢與黃葉葉色變化趨勢相一致，即比值越大，葉色越黃，比值越小，葉色越綠，表明灑金柏呈現黃色可能是由Car/Chl比值較高導致。金葉植物葉片呈色原因在銀杏‘萬年金’中有相關研究，認為Car/Chl和Car/Chl a比值偏高可能是子代無性系中葉片呈現黃色的主要原因之一[19]。對金葉白蠟的研究也發現，其葉片呈現黃色的內在原因是Chl含量低于對照白蠟，而Car含量高于對照白蠟[20]。與金葉白蠟類似的是，本研究中灑金柏在夏季也出現略微反綠的現象，觀賞價值降低，相比春季，夏季灑金柏中黃葉的Car含量顯著降低，Chl含量升高，這可能是由于夏季高溫、強光照等環境因子不利于Car合成和積累導致。

在有的植物中，黃葉形成與類黃酮的含量緊密相關，類黃酮物質會在植物的葉片、花瓣和果實中大量的積累，隨著類黃酮物質含量的變化植物的葉色也會隨之改變[21]。本研究中，3—7月，綠葉中類黃酮含量顯著高于黃葉，這與楊瞬博對銀杏的研究結果相符[22]。但8—10月，類黃酮含量在黃葉中與3—7月含量無差異，綠葉中類黃酮含量顯著低于3—7月含量，黃葉與綠葉含量無差異，表明秋季溫度的降低并沒有促進黃酮物質的積累，因此推測盡管灑金柏中類黃酮絕對含量較高，但類黃酮不是灑金柏黃葉的主要顯色物質。

植物葉片氣體交換參數是衡量光合特征的重要指標，Chl含量的高低一定程度上能夠反應光合作用高低。通過灑金柏的光響應曲線可知，在相同光強條件下，黃葉的Pn顯著小于綠葉；黃葉在PAR＞1200 μmol/(m2·s)后，Pn無顯著差異，達到飽和狀態，而綠葉在PAR＞1400 μmol/(m2·s)后，Pn達到飽和。這與倪妍妍等[23]對側柏光響應曲線研究結果基本相符，在側柏中，5年生接穗的光飽和點最高，達(1824±148)μmol/(m2·s)。但灑金柏中，在PAR＜200 μmol/(m2·s)時，Pn的升高幅度較快；當PAR在200～1200 μmol/(m2·s)之間，Pn基本呈勻速上升狀態，隨后保持平穩。這與對側柏光響應曲線的研究略微差異。

金色葉植物一般生長量小，光合能力和比葉質量均顯著低于相應的綠葉植株[24-25]。如對金葉女貞的研究發現，其光合能力低于小葉女貞，Car/Chl比值則高于小葉女貞[24]；中華金葉榆是普通白榆的天然黃葉突變體，黃葉苗生長緩慢，凈光合速率顯著低于綠葉苗[25]；對于金葉國槐的研究發現同一時期普通國槐的凈光合速率高于金葉國槐[26]。本研究對灑金柏不同月份光合作用的研究表明，光合氣體交換參數基本呈先上升后降低的趨勢，且光合指標與色素含量指標之間呈顯著正相關性，這與多數研究結果相符。3—8月，黃葉的Pn顯著低于綠葉，雖然Tr也低于綠葉，但最終WUE低于綠葉，表明綠葉在生長過程中對水分的利用效率更高。8月之后，葉片趨向成熟，而此時黃葉和綠葉的WUE均顯著高于夏季，說明灑金柏秋冬季節對水分有較高的利用效率。這從側面反映可能其抗旱能力較強，在秋冬季水分條件較差情況下，能夠通過調節自身生理系統來滿足生長需求，這對于北方缺水城市來說至關重要。