外周血單個核細胞中circTCF25表達水平在肺源性心臟病患者診斷及預后中的應用

王敏 袁博 張一凡 龐咪 潘金

(西安交大醫學院附屬市九院(西安市第九醫院)心血管內科，陜西 西安 710054)

肺源性心臟病(cor pulmonale，CP)是由于慢性肺組織、肺血管病變引起肺血流受限、肺動脈壓力增加，從而引起右心室肥厚、擴張，甚至右心功能衰竭[1-2]。近年來研究發現環狀RNA(circular RNA，circRNA)在心血管疾病的發生和發展中發揮重要作用[3-4]。circRNA可通過多種機制調控基因表達，其中最重要機制之一是與微小RNA(microRNA，miRNA)競爭性結合，充當“miRNA海綿”，從而調控miRNA的靶基因[5-6]。既往研究[7]指出miRNA-103/107在肺動脈高壓血管重塑中發揮重要調控作用，而肺動脈高壓作為CP病理生理的中心環節，筆者推測與miRNA-103/107保守結合的circTCF25可能與CP病程密切相關，可能是CP的潛在分子標志物。基于此，本研究通過檢測CP患者和健康人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中circTCF25的表達差異，探討其對CP診斷和預后預測的價值，旨在為CP診斷和預后預測尋找可靠的分子標志物，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年11月—2018年11月西安市第九醫院收治的52例慢性CP患者(CP組)。納入標準：(1)符合1977年中國肺源性心臟病專業會議制定的診斷標準；(2)年齡>18歲；(3)本研究取得患者知情同意，經醫院倫理委員會審批通過。排除標準：(1)合并腫瘤、嚴重的肝腎疾病或全身代謝性疾病患者；(2)有心肌梗死、肺梗死或腦梗死史者；(3)合并神經系統疾病者；(4)糖尿病、先天性心臟病及其他心血管疾病等。52例CP患者中，女性20例，男性32例；年齡41～74(65.63±6.40)歲；原發疾病：慢性阻塞性肺病41例，特發性肺動脈高壓11例。另選取同期性別、年齡與CP組患者相匹配的健康體檢者30例作為正常對照組，均排除糖尿病和各種心血管疾病等。兩組入院后均完成動脈血氧分壓(PaO2)、腦鈉肽(BNP)、平均肺動脈壓(mPAP)及心臟超聲檢查；對CP患者隨訪觀察1年，隨訪以電話及門診方式進行，記錄患者隨訪期內預后情況。

1.2 方法

1.2.1 外周血分離PBMCs

所有研究對象入院后抽取清晨空腹靜脈血5 mL，離心后分離血漿，加入淋巴細胞分離液(達科為生物技術股份有限公司)后，使用梯度離心法提取PBMCs，加入TRIzol試劑(美國Invitrogen)充分裂解后于-80 ℃條件下保存。

1.2.2 circRNA的提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測

根據TRIzol試劑盒說明書步驟提取PBMCs總RNA。提取的總RNA以逆轉錄試劑盒(羅氏)合成cDNA，以GAPDH為內參，采用全自動熒光定量PCR分析儀(羅氏cobas z480)進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測circTCF25相對表達水平。擴增條件：以95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s順序進行擴增反應；以95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s順序進行溶解反應。circTCF25相對表達水平采用ΔΔCt法由GAPDH標準化后得到。引物序列由廣州吉賽生物有限公司合成，GAPDH-F：5’GGGAAACTGTGGCGT GAT；GAPDH-R：5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA；circ TCF25-F：5’GATACAGCAGGCGCTCACCAT； circTCF 25-R：5’TCGGGTCTGCGGTAATCCA。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、年齡、體質量指數(BMI)比較無顯著差異(P>0.05)；CP組PaO2顯著低于對照組(P<0.05)，BNP水平顯著高于對照組(P<0.05)，右室內徑顯著大于對照組(P<0.05)，詳見表1。

2.2 circTCF25在CP組和對照組PMBCs中的表達水平比較

CP組PMBCs中circTCF25水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 CP組和對照組circTCF25水平比較

2.3 CP患者PMBCs中circTCF25水平與PaO2、BNP的相關性分析

采用Pearson相關分析CP患者circTCF25表達水平與PaO2、BNP的相關性，結果顯示circTCF25表達水平與PaO2呈顯著負相關(r=0.633，P<0.05)，與BNP水平呈顯著正相關(r=0.528，P<0.05)。

2.4 PMBCs中circTCF25表達水平對CP的診斷價值

應用ROC曲線確定circTCF25診斷CP的最佳臨界值，取約登指數最大時對應的circTCF25水平作為臨界值，結果顯示circTCF25診斷CP的最佳截值為1.37，診斷的AUC為0.834(95%CI0.734～0.908)，與AUC=0.5比較，差異有統計學意義(Z=9.219，P<0.001)。見表3、圖1。

表3 PMBCs中circTCF25診斷CP的診斷效能

圖1 PMBCs中circTCF25診斷CP的ROC曲線

2.5 PMBCs中circTCF25表達水平與CP患者預后的關系

截止隨訪時間，52例CP患者均獲得完整隨訪，其中全因性死亡8例，占15.38%。根據隨訪臨床結局，將CP患者分為生存組與死亡組，死亡組circTCF25表達水平顯著高于生存組(P<0.05)，見表4。應用ROC曲線確定circTCF25預測CP患者預后不良的最佳臨界值，取約登指數最大時對應的circTCF25水平作為臨界值，結果顯示外周血circTCF25預測CP患者預后不良的最佳截值為1.74，預測的AUC為0.722(95%CI0.636～0.798)，與AUC=0.5比較，差異有統計學意義(Z=4.708，P<0.001)。見表5、圖2。

表4 不同結局CP患者PMBCs中circTCF25表達水平比較

表5 PMBCs中circTCF25預測CP患者預后的預測效能

圖2 PMBCs中circTCF25預測CP患者預后的ROC曲線

3 討論

隨著高通量測序技術的成熟及應用，circRNA被發現與多種人類疾病的發生和發展密切相關，其生物學功能也被越來越多的研究所揭示。眾多研究[8-10]發現，circRNA可通過充當miRNA海綿、競爭性結合miRNA與蛋白質結合形成復合體等方式調控基因表達。近來發現，一些循環血的circRNA表達變化與疾病具有密切的關系，可用作疾病早期診斷和預后評估的生物標志物[11]。circRNA的分子結構形似封閉的圓環，無5’端帽子結構和3’端多腺苷酸尾部，因此難以被核酸外切酶降解[12]，也讓circRNA作為診斷或預后評估的生物分子標志物成為可能。circRNA的結構特點為較好的穩定性和序列保守性，其與miRNA的相互作用在不同疾病中發揮相似的作用。如果某種miRNA參與CP疾病進程，則與其結合的circRNA同樣可能與CP進程有關[13]。既往研究[7]發現miRNA-103/107在肺動脈高壓血管重塑中發揮重要調控作用，而肺動脈高壓作為CP病理生理的中心環節，因此與miRNA-103/107保守結合的circTCF25可能與CP病程密切相關。

本研究檢測了circTCF25在CP患者和健康人PMBCs中的表達水平，結果顯示circTCF25表達水平在CP組較對照組明顯上調，提示circTCF25可能與CP病程密切相關。CP患者晚期出現心肺功能衰竭時診斷相對容易，但早期診斷仍存在一定難度。肺動脈高壓是慢性CP的病理生理的中心環節，如能早期針對CP原發疾病進行干預，或有針對性的對肺動脈壓進行控制，有可能逆轉疾病進程或右心功能的進一步惡化。因此早診斷、早治療對改善慢性CP患者預后，提升其生存質量臨床意義重大。通過ROC曲線分析，筆者發現circTCF25對CP具有較好的診斷效能，AUC為0.834(95%CI0.734～0.908)，因此circTCF25可能是CP的潛在分子診斷物。

CP患者右心功能受損，入院后行血氣分析檢查表現為PaO2值明顯下降，而靜脈血BNP水平顯著升高，與既往報道[14]相一致。通過Pearson相關性分析發現circTCF25表達水平與PaO2呈顯著負相關，與BNP水平呈顯著正相關，說明circTCF25與CP患者病情嚴重程度存在密切關聯。Deng等[7]研究指出miRNA-103/107對肺動脈血管平滑肌增殖具有抑制性調節作用，在低氧誘導的肺動脈高壓大鼠，mPAP及右心室收縮壓明顯升高，右心室及肺血管重構，同時miRNA-103/107表達下調，這與本研究中circTCF25表達上調的結果相一致，因此推測circTCF25可能通過“海綿機制”與miRNA-103/107結合，調控下游靶基因表達的形式參與CP病程，但這一機制及相關信號轉導機制有待研究進一步明確。晚期CP患者多預后較差，患者多因右心衰竭致死[15]。本研究通過比較不同臨床結局患者circTCF25表達水平發現，死亡組circTCF25水平顯著高于生存組，提示高circTCF25表達水平者預后差。通過ROC曲線進一步分析，確定circTCF25預測CP患者預后不良的AUC為0.722(95%CI0.636～0.798)，提示其對CP患者預后具有較好的預測價值。相信隨著circRNA在CP發生、發展中的作用機制越來越明確，其作為CP分子標志物的應用價值也會越來越清晰。

綜上所述，本研究結果表明PBMCs中circTCF25表達水平在CP患者明顯上調，其對CP診斷和預后評估具有較好的應用價值，可能是CP早期診斷和預后預測的潛在分子標志物。本研究不足之處在于樣本數量較小，結果有待進一步大樣本研究驗證。