乙肝HBsAg酶聯免疫吸附試驗檢測信號灰區與血清免疫逃逸變異HBsAg的關系研究

薛方 李鸝

(1.陜西省第四人民醫院檢驗科，陜西 西安 710043；2.陜西省疾病預防控制中心計劃免疫所(疫苗臨床評價中心)，陜西 西安 710054)

乙型肝炎病毒作為臨床常見的病毒類型，具備較強的傳染性，且屬于脫氧核糖核酸病毒，隸屬嗜肝脫氧核糖核酸病毒科[1]。一旦感染后，可直接影響患者日常生活以及身體健康，若未能夠盡早發現并及時提供科學療法，隨著疾病持續發展且不斷加重，部分患者可進展成為肝硬化或者肝癌，直接危及生命安全[2-3]。有報道指出[4]，乙型肝炎病毒患者的外周靜脈血中可測出乙型肝炎病毒DNA、特異性抗體以及抗原等，但部分患者在實施酶聯免疫吸附試驗(ELISA)時，其中HBsAg檢測信號可能位于灰區，直接影響檢驗結果[5-6]。本文探究乙肝HBsAg ELISA檢測信號灰區與血清免疫逃逸變異HBsAg的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇我院2018年8月至2020年8月納入的100例乙型肝炎病毒患者，其中男54例，女46例；年齡36～70歲，平均年齡(52.38±1.24)歲；初中至以下36例，高中38例，大專至以上26例；體質量50～74 kg，平均體質量(63.48±1.02)kg；身高157～180 cm，平均身高(170.59±1.45)cm。納入標準[7]：患者與家屬知情同意，經本醫院倫理委員會批準通過；符合疾病診斷標準，均存在食欲不振、營養不良、腹部不適、面色晦暗、消瘦等癥狀；ELISA中顯示乙肝HBsAg檢測信號處在灰區。排除標準[8]：存在免疫系統缺陷或者疾病者；存在精神方面疾病或者溝通、聽力障礙者；合并肝炎史、嚴重心腦血管疾病者；生化指標水平波動較大者。

1.2方法 收集并整理所有患者的病歷資料，分別利用市售ELISA試劑盒以及G6-ELISA試劑測定患者的血清免疫逃逸變異HBsAg。選擇乙型肝炎病毒HBsAg檢驗試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)，利用ELISA法測定信號灰區的患者血清HBsAg，并嚴格遵照說明書要求進行。市售ELISA檢查結束后再次進行G6-ELISA檢驗，選擇單克隆抗體(mAb)與pH9.6的碳酸緩沖液稀釋，將稀釋后的G6-mAb緩沖液緩慢加入酶標反應板上的各個孔內，劑量均保持在85uL左右，最后置于4℃條件下12 h。隨后將G6-mAb樣本置于非離子表面活性劑的磷酸緩沖液，重復洗滌，單次洗滌時間控制在60 s左右，放入2%牛血清白蛋白，每孔劑量85uL，置于37℃條件下封閉2 h左右。清除稀釋液中封閉液，加入不同稀釋濃度的血清樣本，酶標反應孔劑量50uL，置于37℃條件下孵育30 min。常規洗板，加入羊抗HBS-HRP(50uL)，以上述同樣的條件進行孵育。再次洗板并孵育，加入TMB-H2O溶液，使其顯色，時間10 min左右，隨后選擇硫酸溶液(2 mol/L)停止反應，將其放在酶標儀上，測定450 nm波長位置的吸光度，若P/C≥2.1判定成陽性。

1.3觀察指標 對比兩組血清免疫逃逸變異HBsAg陽性率以及P/C數據，分析乙肝HBsAg ELISA檢測信號灰區與血清免疫逃逸變異HBsAg的關系。其中超臨界：P/C水平處于2.6～5.0范圍；亞臨界：P/C水平處于1.2～1.8范圍；臨界：P/C水平處于1.9～2.5范圍。陽性率是超臨界率+亞臨界率+臨界率之和[9]。

2 結 果

2.1兩組血清免疫逃逸變異HBsAg陽性率的對比 市售ELISA組的陽性率明顯低于G6-ELISA組(χ2=5.357，P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清免疫逃逸變異HBsAg陽性率的對比[n(%)，n=100]

2.2兩組P/C數據的對比 市售ELISA組的超臨界、亞臨界、臨界、總P/C水平均低于G6-ELISA組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組P/C數據的對比

3 討 論

目前，乙型肝炎病毒已經成為全球范圍內嚴重的公共衛生問題，雖然乙肝疫苗能夠有效控制疾病的患病率以及傳播范圍，但近幾年乙型肝炎病毒的危險因素不斷增多，尤其是生活水平的提升，飲食以及生活習慣發生極大改變，加上工作與生活壓力導致免疫能力降低，直接提升乙型肝炎病毒的患病率[10-11]。若未能夠盡早發現并及時選擇相關干預，可能增加失代償性肝硬化、肝細胞癌等嚴重并發癥，給患者帶來嚴重后果[12]。因此選擇有效檢驗方式成為關鍵。

HBsAg檢查是乙型肝炎病毒中最為多見的診斷方式。以往研究發現，乙肝HBsAg ELISA檢測信號灰區的產生可能與自身免疫物質缺少、檢驗標本或者試劑污染、食物抗體、血清中某因子過量以及檢驗操作的規范性等因素存在密切相關性[13-14]。但關于乙肝HBsAg ELISA檢測信號灰區與血清免疫逃逸變異HBsAg關系尚未統一。本文結果顯示，市售ELISA組的陽性率明顯低于G6-ELISA組(P<0.05)。市售ELISA組的超臨界、亞臨界、臨界、總P/C水平均低于G6-ELISA組(P<0.05)，提示乙肝HBsAg ELISA法信號灰區患者在排除外界因素干擾的情況下，可明確成乙型肝炎病毒感染，而G6-ELISA法針對血清免疫逃逸變異HBsAg的敏感性較高。經分析發現，目前我國市售的ELISA試劑均選擇單克隆抗體，且主要針對HBsAg a決定簇，或者與空間結果存在關聯性的抗原定位點，進而使抗原性飄移對表達抗原、檢測試劑中抗體的結合能力造成一定影響，最終導致檢驗結果出現偏差[15]。除此之外，雖然同一抗體在血清免疫逃逸變異HBsAg可發揮免疫反應，但其親和力較低，也可造成乙肝HBsAg ELISA檢測信號灰區產生。

綜上所述，乙肝HBsAg ELISA檢測信號灰區通常是由血清免疫逃逸變異HBsAg造成，需有效提升其檢驗能力，保障后續疾病診斷結果的準確性。