34個玉米雜交組合的SSR聚類分析

王麗華 郭 建

（安徽科技學院，安徽 鳳陽 233100）

玉米（Zeamays L.）是一年生的禾本科植物，玉米不僅可以作為糧食，還可以作為飼料、工業原料等。就種植面積而言，已經超越水稻、小麥，成為國內目前種植的第一大農作物。由于玉米種植面積越來越大，對玉米新品種的需求也越來越大，這為玉米育種工作提供了機遇和挑戰，尤其近幾年每年參加國家和各省市的區域試驗的玉米雜交組合達數千個。雖然玉米已經日益凸顯其在農業發展上的重要性，但就我國的玉米種質資源來說，其遺傳基礎比較狹窄。李俊芳等在對國家玉米主產區預試品種的SSR分析中指出我國現階段的玉米育種的親本組合有比較強的趨同趨勢，越是優良的品種趨同趨勢越明顯。

SSR(Simple sequence Repeats)分子標記的出現對玉米育種的快速發展起到了非常重要的作用，SSR 是一種以特異性引物為基礎的分子輔助標記技術，也稱微衛星DNA，是由幾個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列。SSR分子輔助標記技術以其標記的多態性高、重復性好、操作簡單、成本較低等優點，因此被廣泛應用在育種工作中。孫友位等利用SSR標記對85個玉米自交系進行聚類分析，聚類結果與自交系系譜關系基本一致，說明SSR標記在劃分種質資源的親緣關系是比較理想的。

試驗選用的是2012-2015年國家東南區區域試驗的玉米雜交組合種子，采用SSR標記技術，對34個玉米雜交組合進行SSR標記及聚類分析，研究其親緣關系的遠近，對指導玉米育種實踐，有一定的積極作用。

1.材料與方法

1.1 材料

試驗材料為國家東南區區域試驗2012-2015年的玉米雜交組合（見表1），分別取30粒種子于發芽盒內砂床，28℃發芽室內發苗。期間每天澆水兩次，待幼苗長出5-6片葉子時進行DNA的提取。

表1 試驗材料的編號對應試驗材料名稱

1.2 試驗方法

1.2 .1 DNA的提取

（1）研磨 選取生長健壯的幼苗，取適量的葉片，用剪刀剪成小段，放置帶有標記的2ml離心管中，每個離心管放置兩粒鋼珠，剪刀每次用完后都要用衛生紙擦干凈以防止不同玉米雜交組合間DNA的混雜。把離心管放到液氮中冷凍數分鐘后，快速放入研磨機中進行研磨，研磨后倒出鋼珠，把研磨的玉米葉片粉末倒入另一帶有標記的2ml離心管中。

（2）裂解 將上述樣品管加入65℃預熱的SDS提取液 600μL，快速搖勻后放入到65℃的水浴鍋中，保溫30min，期間每10min輕微搖晃3-4次，從水浴鍋中取出樣品管，加入150μL 5M預冷的醋酸鉀后放入冰箱中冷凍存放30min。從冰箱中取出冷凍的樣品加入事先配好的24︰1的氯仿︰異戊醇，在振蕩器上震蕩30min，使其充分混勻。

（3）離心 將樣品管放置在離心機上12000r/min離心5min，用移液槍小心吸取上清液200μL加入到帶有標記的1.5ml離心管中，加入1.5倍的預冷的無水乙醇，輕輕搖晃，放置冰箱中冷凍20min后取出離心，倒掉離心管中的液體。

（4）漂洗 向離心管中加入400μL 70%的乙醇，輕輕搖晃數次，靜置5min后，放入離心機中，12000r/min離心1min，棄廢液。把離心管倒扣在吸水紙上，晾干后，加入100μLddH2O后，用旋渦振蕩器進行震蕩，待充分溶解后，冷凍保存。

1.2 .2 DNA的檢測

采用紫外光光度計（波長260nm）檢測DNA濃度，結果表明，34個玉米樣品DNA的濃度都能符合本試驗的要求。

1.2 .3 SSR的擴增條件

對142對玉米的SSR引物進行多態性篩選，從中選出多態性好，重復性高的引物再對34個玉米雜交組合進行PCR的擴增。

PCR的擴增體系：試驗采用10μL反應體系，其中ddH2O 4μL，Taq Buffer（含有Mg2+）1μL，引物1.5μL，dNTP 1μL，Taq聚合酶0.5μL，DNA 2.0μL。

PCR擴增的程序：PCR反應程序為94℃預變性7min，94℃變性30s，50℃退火50s，72℃延伸1min，共36個循環。72℃再延伸7min，反應結束后，4℃的冰箱中保存。

1.2 .4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

PCR擴增產物用8%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，用0.2%的硝酸銀溶液進行染色，染色15min，染色完成后，加入200ml的顯色液，放置在脫色搖床上，加入2ml甲醛溶液，顯色10min，條帶清晰時，倒掉廢液，用自來水緩慢沖洗幾次后，取出，掃描成像并記錄。

1.2 .5 數據處理

SSR是共顯性標記，同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶具有同源性。有帶記為1，無帶記為0，形成SSR數據矩陣。用DPS7.05軟件進行數據處理，以Jaccard系數、用UPGMA（類平均數）法進行聚類分析。

2.結果與分析

2.1 34個玉米雜交組合的引物篩選

試驗共有142對SSR引物，在對引物的篩選過程中，首先隨機選取多個SSR引物對34個玉米雜交組合進行PCR的擴增。電泳檢測后選取清晰的條帶進行比較，選出2015A1、2015A4玉米雜交組合的DNA，進行SSR 引物的篩選。共篩選出多態性較好、條帶清晰的引物50對。

圖1 SSR引物篩選圖

2.2 SSR標記在34個玉米雜交組合間的多態性分析

用篩選出的50對SSR引物對34個玉米雜交組合進行擴增，結果表明，擴增條帶的數目隨引物和樣品DNA的不同在1~8之間變化，多態位點百分率最低為62.5%，最高為100%。（見表2）通過與Marker比較可以看出，SSR引物擴增出的條帶集中在100-500bp之間。

表2 SSR引物序列與擴增結果

圖2 1號引物擴增結果

2.3 34個玉米雜交組合的聚類分析

利用UPGMA法進行聚類分析，結果表明（見圖3）：以Jaccard系數0.80為標準，可以將2012-2015年參加國家東南區區域試驗的玉米雜交組合分為三大類：第一類為1、3、2、6、12、10、17、26、22、33、18、31、11、21、30、28、25、5、16、4、13、29、27、34、8、14、24、9、20、23，共30個，占88.2%，且雜交組合數量很多，說明近幾年參加區試品種的遺傳基礎差異較窄。第二類為32，第三類為7、15、19，從圖中可以看出第一類的親緣關系較近，第三類的Jaccard系數最大，與第一類相比，其親緣關系相對較遠，但從整體上來看，34個雜交組合的Jaccard系數集中在0.26-0.94之間，說明34個玉米雜交組合間的親緣關系差別不大。

圖3 34 個玉米雜交組合的SSR 標記聚類圖

3.討論

3.1 SSR的穩定性及多態性

大量研究表明，SSR標記的試驗操作簡單、省時且成本較低。利用SSR標記的多態性高，結合相應的分析如相關分析、聚類分析等數量遺傳分析手段，可以對不同的玉米雜交組合進行分類，判斷其親緣關系的遠近。韓萌等利用23對SSR引物對101份貴州地方種質進行遺傳多樣性分析，結果表明，SSR多態性位點檢測擴增條帶為7-21個，平均11個，每個位點的多態性信息量變幅為0.753-0.945，平均0.857。與之相比，本試驗利用50對SSR引物對34個玉米雜交組合進行遺傳多樣性分析，結果表明，SSR多態位點檢測擴增條帶為1-8個，平均3個，每個位點的多態性信息量變幅為0.625-1.000，平均0.984。所以試驗從142對SSR引物篩選出的50對引物對34個玉米雜交組合的SSR多態性分析結果是可信的。

由于玉米是異交授粉作物，存在自交衰退現象，而異交可以增強后代的產量、品質等，所以大田上的生產用種是通過自交系間雜交得到的F1。玉米自交系的遺傳多樣性是育成新品種的重要基礎。大量研究表明SSR標記可以有效地應用在玉米等農作物種質的遺傳變異研究及類群的劃分。

3.2 親緣關系

利用UPGMA方法進行聚類分析，Jaccard系數主要集中在0.26-0.94之間，說明這些雜交組合親緣關系差別不大，遺傳基礎比較狹窄，不利于玉米品種多樣性的形成，也不利于玉米品種抵抗風險的能力，所以在玉米育種上，利用更加豐富的種質資源。