耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌易感因素及其碳青霉烯酶表型分析

許曉波，杜恒超，陸爾杰

(1.浙江中醫藥大學 研究生院，浙江 杭州 310053；2.浙江省榮軍醫院 檢驗科，浙江 嘉興 314001)

碳青霉烯類藥物是一類具有β內酰胺環的抗生素。隨著此類藥物的應用，臨床上對其產生耐藥的革蘭陰性桿菌也越來越多，這給臨床治療帶來巨大的挑戰[1]。從2005年到2017年，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率從3.0%上升到20.9%[2]。分析耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌(carbapenem-resistantEnterobacterales, CRE)感染的危險因素可以在一定程度上避免耐藥菌的產生，為避免易感因素的暴露提供依據，同時也是預防醫院感染的重要依據。碳青霉烯酶可分為A、B、C、D 4類，其中A、C和D類具有水解碳青霉烯類活性而被稱為絲氨酸碳青霉烯酶。B類需要金屬離子來催化活性，金屬碳青霉烯酶就屬于此類酶[3]。研究[4]顯示，阿維巴坦有廣泛抑菌作用，但僅對絲氨酸碳青霉烯酶有抑制作用。本文分析CRE產碳青霉烯酶情況，以期為臨床應用阿維巴坦復合制劑藥物提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集浙江省榮軍醫院2019年6月—2020年1月臨床感染的耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌114株，其中包括大腸埃希菌14株、肺炎克雷伯菌86株、奇異變形桿菌5株、黏質沙雷菌8株、普羅維登斯菌1株，并選擇同期同科室收集的碳青霉烯類藥物敏感腸桿菌目細菌(carbapenem-sensitiveEnterobacterales，CSE)110株作為對照組(菌株分布與耐藥組大致相同)。114株CRE采集的患者為CRE組，男79名，女35名；平均年齡(70.83±18.29)歲。110株CSE采集的患者為CSE組，男66名，女44名，平均年齡(73.77±17.23)歲。兩組研究對象年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 數據收集 查閱相關文獻及資料，結合患者病歷病程，收集患者以下資料：患者年齡、性別，住院時間是否大于30天、ICU入住史、7天內是否進行機械通氣，基礎疾病情況(肺部疾病、高血壓、糖尿病)，抗生素使用情況(碳青霉烯類、氨基糖苷類、β內酰胺類復合制劑、喹諾酮類)。

1.3 藥敏試驗 采用法國梅里埃VITEK-2 COMPACT 全自動微生物鑒定分析儀及配套 GN 鑒定卡、AST-GN13 藥敏卡進行鑒定。根據CLSI M100(2019版)中的藥敏判斷標準，CRE為腸桿菌目細菌中對厄他培南最小抑菌濃度 MIC≥2 μg/mL、對亞胺培南或美羅培南 MIC≥4 μg/mL的菌株。所有耐藥菌株均通過紙片法進行驗證，亞胺培南及美羅培南抑菌圈直徑≤19 mm(變形桿菌屬、普羅威登菌、摩根氏菌除亞胺培南外的碳青霉烯類藥物耐藥確認為CRE)。質控菌株為大腸埃希菌 ATCC25922、肺炎克雷伯菌 ATCC700603及銅綠假單胞菌 ATCC27853，所有操作嚴格按照操作規程進行。

1.4 耐藥表型分析

1.4.1 mCIM試驗與eCIM試驗 改良碳青霉烯類失活法(modified carbapenem inactivation method，mCIM)試驗：取1 μL接種環菌于含2 mL TSB肉湯試管中，振蕩混勻后加入1張含10 μg美羅培南的無菌紙片。乙二胺四乙酸碳青霉烯類失活法(ethylenediaminetetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM)試驗：取1 μL接種環菌于含2 mL TSB肉湯試管中，振蕩混勻后加入1張含10 μg美羅培南的無菌紙片，加入20 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。兩個實驗的試管均放置于35 ℃孵育(240±15) min。用10 μL接種環取出美羅培南紙片，貼于已涂布大腸埃希菌ATCC25922懸液的MH平板表面，35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直徑。mCIM試驗抑菌圈直徑6～15 mm，或抑菌圈直徑16～18 mm但抑菌圈內有針尖樣菌落，為mCIM試驗陽性結果；抑菌圈直徑≥19 mm為陰性結果；抑菌圈直徑16～18 mm，或抑菌圈直徑≥19 mm但抑菌圈內有散在菌落為中介結果。mCIM試驗陽性結果表示菌株產碳青霉烯酶。當eCIM 試驗與mCIM試驗抑菌圈直徑相差≥5 mm時為陽性結果，即菌株產金屬碳青霉烯酶；當eCIM試驗與mCIM試驗抑菌圈直徑相差≤4 mm時為陰性結果，即菌株產絲氨酸碳青霉烯酶，見封三圖1A、圖1B。

1.4.2 酶抑制劑增強試驗 CRE菌株調0.5麥氏濁度，涂布于MH平板上，在平板四角距邊10 mm分別貼上4張亞胺培南紙片，其中1張紙片加0.1 mol/L EDTA 10 μL，其中1張紙片加50 mg/mL 3-氨基苯硼酸6 μL，其中1張紙片同時加0.1 mol/L EDTA 10 μL和50 mg/mL 3-氨基苯硼酸6 μL，另1張紙片不加試劑。加EDTA/硼酸試劑紙片與不加試劑紙片抑菌圈直徑相差>5 mm，表明分別產金屬酶和絲氨酸酶。若加EDTA/硼酸試劑紙片與不加試劑紙片抑菌圈直徑均>5 mm，表明既產金屬酶又產絲氨酸酶，見封三圖1C、圖1D。

1.5 統計學分析 采用SPSS22.0軟件，計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 影響CRE感染的單因素分析 CRE組和CSE組患者住院時間大于30天、機械通氣、患有糖尿病、聯合使用抗生素、使用碳青霉烯類藥物、使用氨基糖苷類藥物、使用β內酰胺酶復合制劑、使用喹諾酮類藥物、入住ICU比例比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 影響CRE感染的單因素分析[n(%)] Table 1 Univariate analysis of CRE infection [n(%)]

2.2 影響CRE感染的Logistic回歸分析 以單因素分析結果為基礎，P<0.05的因素為自變量，采用Logistic回歸分析對CRE感染的影響因素進行分析。結果顯示：住院時間大于30天、患有糖尿病、使用碳青霉烯類藥物、入住ICU、使用β內酰胺酶復合制劑是CRE感染的危險因素(P<0.05)，聯合使用抗生素是CRE感染的保護因素(P<0.05)，見表2。

表2 影響CRE感染的Logistic回歸分析Table 2 Logistic regression analysis of CRE infection

2.3 耐藥表型分析 mCIM試驗與eCIM試驗結果顯示，114株CRE菌株中產絲氨酸碳青霉烯酶90株、產金屬碳青霉烯酶24株。酶抑制劑增強實驗結果顯示，114株CRE菌株中產絲氨酸碳青霉烯酶90株、產金屬碳青霉烯酶20株，既產絲氨酸碳青霉烯酶又產金屬碳青霉烯酶4株。

3 討論

文獻[5]報道，CRE細菌可在腸道定植并在免疫力低下時發病。ICU患者免疫力低下且面臨機械性操作，若醫院感染防護措施不到位則容易導致耐藥菌院內感染，危及患者生命。文獻[6]顯示，手術室、ICU、急診科是CRE感染的重災區。碳青霉烯類藥物可在抗生素壓力下導致細菌選擇性產生耐藥，易導致CRE菌株的產生。本研究檢出CRE菌株114株，其中肺炎克雷伯菌86株(75.44%)，與秦慧玲等[7]研究結果一致。本研究結果顯示，長時間住院、入住ICU、使用碳青霉烯類藥物、糖尿病會導致患者更容易被CRE感染，這與楊璐等[8]分析的CRE感染的易感因素相符。

目前對CRE敏感的藥物有多黏菌素、替加環素、磷霉素，但從總體上而言，治療方案有限[9]。頭孢他啶/阿維巴坦對A、C、D類酶有一定的效果，對B類酶無效，因此耐藥表型檢測對臨床用藥具有一定的指導作用[10]。研究[11]表明，mCIM聯合eCIM試驗、酶抑制劑增強試驗在碳青霉烯酶表型鑒定中有較好的特異性和敏感性。mCIM聯合eCIM試驗的符合率為97.5%，酶抑制劑增強試驗的符合率為96.3%[12]。CRE菌株的產酶情況結合病情，可以制定更為合理的用藥方案。

綜上所述，長時間住院、入住ICU、使用碳青霉烯類藥物和β內酰胺酶復合制劑、糖尿病可導致患者更容易被CRE感染；開展耐藥表型分析，可指導臨床合理使用抗菌藥物。