MALDI-TOF MS技術(shù)在不同培養(yǎng)時間對絲狀真菌的鑒定結(jié)果比較

廖清松，李紅兵（通訊作者），葉慧明，曾小剛，張 強（內(nèi)江市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科 四川 內(nèi)江 641000）

免疫抑制劑和器官移植技術(shù)在自身免疫病、艾滋病、腫瘤等疾病中的運用逐年增加，引發(fā)曲霉等絲狀真菌的感染率逐年攀升，死亡率也有增高趨勢[1-2]。同時，種類繁多的絲狀真菌不同菌種間存在不同的耐藥譜[3]，因此，臨床微生物實驗室快速準確進行絲狀真菌的種屬鑒定對于指導臨床診療十分重要。然而，目前，臨床微生物實驗室主要運用形態(tài)學方法進行絲狀真菌分類鑒定[4-5]，實踐過程操作繁瑣、耗時長、準確度低、對生長特征不典型的菌株鑒定困難，需要檢驗人員具有豐富的專業(yè)知識及全面的真菌學鑒定經(jīng)驗。基因測序技術(shù)在細菌真菌鑒定等方面準確度較高，但對費用、技術(shù)要求及實驗室環(huán)境等方面均有較高標準，難以常規(guī)開展，普及性相對狹窄，從而限制了臨床絲狀真菌的快速準確鑒定并影響臨床診療。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）對臨床微生物快速鑒定分析技術(shù)已經(jīng)運用于細菌學鑒定[6]，操作簡單，快速準確。但由于目前的絲狀真菌數(shù)據(jù)庫菌種范圍存在局限，絲狀真菌培養(yǎng)條件不同生長，結(jié)構(gòu)復雜堅硬，使用MALDITOF MS鑒定存在重復性差、準確率低、試驗技術(shù)操作流程不統(tǒng)一等問題。本研究主要設(shè)置28 ℃，對培養(yǎng)生長（24～120）h的菌株進行MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定，觀察評估其鑒定準確率，優(yōu)化實驗鑒定方法。現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 實驗菌株

本文共收集2018年4月—2020年8月臨床絲狀真菌68株作為研究對象，來自我院各標本類型的臨床分離株有27株，其他微生物實驗室惠贈的有41株。分別進行常規(guī)的傳統(tǒng)形態(tài)學方法、DNA測序和MALDI-TOF MS對68株受試絲狀真菌進行檢測鑒定，以DNA測序結(jié)果作為金標準。

1.2 設(shè)備和試劑

Autof ms1000（安圖生物）、28 ℃恒溫培養(yǎng)箱、光學顯微鏡（奧林巴斯）、主要試劑：乙腈、甲酸、CX-氰基-4羥基肉桂酸、土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（安圖生物）、乳酸酚棉藍染色液、酵母基因DNA提取試劑盒和Taq PCR主混合物（北京艾德萊生物科技有限公司中國）。

1.3 方法

1.3.1 形態(tài)學方法 將-20 ℃保存菌株進行復蘇，菌株分別點種于PDA培養(yǎng)基，放置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每隔24 h對菌落形態(tài)、顏色大小等方面進行觀察記錄。使用透明膠帶法粘取足量菌絲和孢子，貼置于加好乳酸酚棉蘭染液的玻片進行染色，放置5 min后，顯微鏡觀察菌絲和孢子等形態(tài)，根據(jù)菌落和鏡下的菌絲大小、顏色、分隔以及產(chǎn)孢方式和結(jié)構(gòu)進行絲狀真菌種類判定。

1.3.2 質(zhì)譜直接涂抹鑒定法 對復蘇后生長的菌落，于生物安全柜中，用牙簽挑取菌膜或者菌落邊緣，盡量避免挑取瓊脂，直接均勻涂抹于靶板上自然干燥，加甲酸1 mL自然晾干后再加1 mL乙腈自然晾干，再加1 mL基質(zhì)液致室溫自然干燥后進行質(zhì)譜鑒定。根據(jù)安圖Autof ms1000使用說明書，調(diào)整其對絲狀真菌的判定閾值，設(shè)置當分值≥8.5分時可鑒定到種，當7分≤分值＜8.5分時鑒定到屬，＜7分時鑒定為無效鑒定，顯示不可信結(jié)果視為不能鑒定。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行處理分析，計數(shù)資料使用頻數(shù)、率（%）表示。

2.結(jié)果

2.1 菌株包括黃曲霉復合群28株（41.2%）、煙曲霉復合群19株（27.9%）、黑曲霉復合群8株（11.7%）、土曲霉復合群2株（2.9%）、構(gòu)巢曲霉4株（5.8%）、雜色曲霉2株（2.9%）、尖孢鐮刀菌3株（4.4%）、草酸青霉1株（1.5%）、阿莎希毛孢子菌1株（1.5%）。標本主要分離自深部痰、肺泡灌洗液、眼和耳道分泌物。

2.2 以≥8.5分作為MALDI-TOF MS對絲狀真菌種水平的判定閾值，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h的菌株在種和屬水平的鑒定率均高于培養(yǎng)72～120 h的種屬水平鑒定率。

2.3 不同時間條件下的鑒定結(jié)果，對照基因序列檢測，結(jié)合形態(tài)學方法（鑒定率63.1%），基于MALDI-TOF MS技術(shù)，對培養(yǎng)不同時間絲狀真菌進行質(zhì)譜鑒定，24 h鑒定到種的準確率47.0%，到屬的準確率38.2%；48 h鑒定到種的準確率為48.5%，到屬的準確率為50%。見表1。

表1 不同培養(yǎng)時間條件下的MALDI-TOF MS絲狀真菌鑒定株數(shù)

3.討論

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對細菌和念珠菌的鑒定優(yōu)勢明顯，有很多學者對其運用于絲狀真菌的研究也成為熱點。而因絲狀真菌細胞壁厚、菌絲和孢子成分等、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫受限及前處理方法差異等因素，導致質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物實驗室的運用一直處于探索階段。本研究共收集臨床常見絲狀真菌68株，其廣泛存在于自然環(huán)境，可通過氣溶膠吸入定植或引起感染，其中鐮刀菌常引起眼角膜感染，黑曲霉為耳道感染的主要病原菌之一。鑒定過程嚴格執(zhí)行質(zhì)譜儀標準操作文件，采取直接涂抹法，加甲酸破壁和乙腈提取的方法進行質(zhì)譜鑒定。結(jié)合形態(tài)學和分子生物學方法，評估絲狀真菌在不同培養(yǎng)時間條件下的MALDI-TOFMS鑒定率。

有研究表明，絲狀真菌的孢子和菌絲成分在不同的生物階段存在差異，其產(chǎn)孢數(shù)量隨著培養(yǎng)時間延長逐漸增多，菌絲體生長相對緩慢。隨著培養(yǎng)時間延長，質(zhì)譜儀對測試菌株的種水平及水平鑒定率均呈明顯下降趨勢。培養(yǎng)24～48 h的菌落容易獲得菌絲體成分，而培養(yǎng)時間大于48 h的菌落表面會覆蓋豐富堅硬的孢子，難以獲得稚嫩菌絲成分，造成破壁困難。為了更加準確的鑒定臨床絲狀真菌，建議用PDA 28 ℃培養(yǎng)24～48 h的新鮮稚嫩絲狀真菌菌落進行MALDI-TOF MS鑒定。

綜上所述，本研究設(shè)計也存在不足，前處理方案希望得到更多學者驗證，使用設(shè)備為鄭州安圖Autof ms1000，尚未進行與布魯克和梅里埃質(zhì)譜儀進行比對，因此，在未來的工作中將繼續(xù)深入研究，不斷優(yōu)化絲狀真菌的前處理方法和步驟[7]。以提高質(zhì)譜在臨床實驗室中的使用效能。