不同F(xiàn)MR1基因的CGG重復(fù)數(shù)及血栓前狀態(tài)基因多態(tài)性的女性生育結(jié)局分析

董 微，張 博（通訊作者），梁 婧，邵 超，戴君妹

（1廣安門醫(yī)院南區(qū)婦科 北京 102600）

（2廣安門醫(yī)院南區(qū)針灸科 北京 102600）

（3廣安門醫(yī)院南區(qū)肛腸科 北京 102600）

脆性X染色體智力缺陷1基因（FMR1）被發(fā)現(xiàn)其5'端非編碼區(qū)的CGG重復(fù)序列在傳代過程中出現(xiàn)異常擴增會引起脆性X綜合征。該區(qū)CGG重復(fù)超過200個以上經(jīng)常會隨著甲基化引起FMR1基因沉默，進而使新生兒因缺乏脆性X智力減退蛋白而出現(xiàn)智力障礙情況[1]。攜帶FMR1前突變者出現(xiàn)卵巢功能早衰的風(fēng)險性將會明顯增大，但是輕度卵巢早衰也可能出現(xiàn)在中間區(qū)，甚至是在正常范圍之內(nèi)，故而FMR1基因CGG重復(fù)數(shù)可能同卵巢儲備功能相關(guān)。血栓前狀態(tài)會增加靜脈血栓栓塞風(fēng)險，導(dǎo)致胎盤灌注不足，進而出現(xiàn)不良妊娠情況[2]。但是在其基因多態(tài)性同不良妊娠方面的研究較少，仍需開展深入研究。為此，本文分析有不良孕產(chǎn)史的育齡期女性FMR1基因的CGG重復(fù)數(shù)以及血栓前狀態(tài)基因多態(tài)性情況，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

將2018年9月—2020年12月本院收治的200例育齡期孕婦作為研究樣本，依據(jù)其有無不良孕產(chǎn)史將其分成常規(guī)組（無不良孕產(chǎn)史，100例）以及實驗組（有不良孕產(chǎn)史，100例）。常規(guī)組與實驗組孕婦中，平均年齡分別為（30.68±2.11）歲、（30.73±2.15）歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）提取全血基因組DNA，采集孕婦2 mL上臂靜脈血，使用磁珠法全血基因組提取試劑盒（NanoMagBio NMG0121），完全按照試劑盒說明書對全血樣本進行基因組DNA提取。儀器：NanoMagBio S-96自動核酸提取儀。（2）PCR擴增，PCR體系有FMR1引物、高GC聚合酶溶液以及高GC擴增緩沖液。除高GC聚合酶試劑外全部試劑實施解凍和渦旋，依據(jù)說明書添加相應(yīng)劑量后實施離心以及渦旋混勻。在96孔PCR檢測板中添加20 ng/ul DNA模板1 μL，將其充分混合后密封，重復(fù)進行渦旋以及離心。之后利用ABI-9700型定量PCR儀（采購自美國ABI）實施擴增。將384PCR板放置在384pcr儀加熱模塊上，核對程序信息，程序如下：94 ℃2 min，之后以 94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 形式開展45次循環(huán)，隨后72 ℃ 5 min，12 ℃長期。用蝦堿性磷酸酶（SAP）將Pre-PCR反應(yīng)后體系中剩余的dNTPs去磷酸化，使其轉(zhuǎn)化為dNDPs，防止dNTPs影響下一步的延伸反應(yīng)。在ddNTPs存在的條件下，通過多重PCR反應(yīng)使引物延伸一個堿基，從而得到目的基因片段中的待測位點——單堿基延伸反應(yīng)。核對程序信息，程序如下：94 ℃ 30 s，之后以 94 ℃ 5 s、52 ℃ 5 s、80 ℃ 5 s 形式開展45次循環(huán)，其中以52 ℃ 5 s、80 ℃ 5 s形式開展5次循環(huán)，隨后72 ℃ 3 min、12 ℃長期。質(zhì)譜檢測實驗中的陽離子交換樹脂純化實驗步驟，通過陽離子交換樹脂純化去除PCR產(chǎn)物中的陽離子等。（3）血栓前狀態(tài)基因檢測，采集孕婦外周靜脈血2 mL，將其置于乙二胺四乙酸試管內(nèi)。通過核酸分離純化和加樣系統(tǒng)（采購自羅氏公司），選擇200 μL全血中基因組DNA開展純化，并選擇100ngDNA，對其中凝血因子Ⅱ基因、凝血因子Ⅴ基因、纖溶酶原激活劑抑制物-1基因5 G/4 G、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因677位點基因型、MTHFR基因1298位點基因型以及甲硫氨酸合成還原酶（MTRR）突變位點實施探究。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）分析CGG重復(fù)序列分布情況。（2）對比兩組孕婦前突變以及灰區(qū)分布情況。（3）分析兩組孕婦前突變核型的CGG重復(fù)數(shù)目。（4）分析不同基因位點同風(fēng)險等級之間關(guān)聯(lián)性。（5）對比不同風(fēng)險等級孕婦生育結(jié)局。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料用頻數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 CGG重復(fù)序列分布情況

在200例孕婦中，不同CGG重復(fù)數(shù)目檢測結(jié)果為35種，其中CGG重復(fù)數(shù)目變異區(qū)間是20～200。CGG重復(fù)數(shù)目排列前三位分別是31（65例，32.50%）、28（55例，27.50%）、35（30例，15.00%）。

2.2 兩組孕婦前突變以及灰區(qū)分布情況比較

實驗組灰區(qū)以及前突變占比均高于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組孕婦前突變以及灰區(qū)分布比較[n（%）]

2.3 實驗組孕婦血栓前狀態(tài)發(fā)生風(fēng)險情況

在100例實驗組孕婦中，12例（12.00%）屬于低風(fēng)險、59例（59.00%）屬于中風(fēng)險、29例（29.00%）屬于高風(fēng)險。

2.4 不同基因位點同風(fēng)險等級的相關(guān)性

伴隨血栓前狀態(tài)發(fā)生風(fēng)險程度的提升，PAI-1基因675位點基因型5 G/5 G以及MTHFR基因677位點基因型TT占比逐漸升高，見表2。

表2 不同基因位點同風(fēng)險等級之間關(guān)聯(lián)性（例）

2.5 不同風(fēng)險等級孕婦生育結(jié)局情況比較

低風(fēng)險孕婦中，1例（8.33%）流產(chǎn)；中風(fēng)險孕婦中，5例（8.47%）流產(chǎn)；高風(fēng)險孕婦中，8例（27.59%）流產(chǎn)。三組流產(chǎn)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 6.262，P＜0.05）。

3.討論

當(dāng)卵巢儲備功能下降時，則說明卵巢內(nèi)存留的可募集卵泡數(shù)量降低，使得卵母細胞質(zhì)量下降，進而出現(xiàn)不孕或生育功能下降等情況。對于存在無誘因反復(fù)流產(chǎn)的患者而言，相較于正常人，其卵巢儲備功能有明顯下降，并且其出現(xiàn)胚泡非整倍體概率增大。伴隨產(chǎn)前診斷和基因檢測技術(shù)在臨床的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)存在不良孕產(chǎn)史的女性，其胎兒染色體異常和基因異常存在明顯關(guān)聯(lián)性[3]。

卵巢儲備功能降低同F(xiàn)MR1基因存在相關(guān)性，并且CGG序列重復(fù)數(shù)在判斷卵巢功能受損程度方法具有重要作用。在本次研究中，常規(guī)組灰區(qū)以及前突變占比均低于實驗組（P＜0.05）。提示存在不良孕產(chǎn)史的女性中，實施FMR1基因篩查，對預(yù)測其妊娠結(jié)局具有重要作用。當(dāng)FMR1基因發(fā)生前突變時，會加速卵泡閉鎖，導(dǎo)致卵泡數(shù)量下降，進而出現(xiàn)卵巢功能減退情況。妊娠早期若出現(xiàn)血栓前狀態(tài)，則會表現(xiàn)為自然流產(chǎn)；而妊娠晚期出現(xiàn)血栓前狀態(tài)，則會引起胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和死產(chǎn)等情況[4]。本次研究中發(fā)現(xiàn)，伴隨血栓前狀態(tài)發(fā)生風(fēng)險程度的提升，PAI-1基因675位點基因型5 G/5 G以及MTHFR基因677位點基因型TT占比逐漸升高。高風(fēng)險孕婦流產(chǎn)率均高于低風(fēng)險、中風(fēng)險。MTHFR是調(diào)節(jié)四氫葉酸以及半胱氨酸代謝的重要酶，PAI-1活性上升會導(dǎo)致纖維蛋白溶解，使得血液呈高凝狀態(tài)，進而誘發(fā)血栓前狀態(tài)[5]。因此，當(dāng)上述兩基因位點基因型占比升高時，孕婦發(fā)生血栓前狀態(tài)的風(fēng)險性則顯著升高，出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局的概率增大。

綜上所述，F(xiàn)MR1基因前突變的風(fēng)險性升高常見于有不良孕產(chǎn)史的女性，而血栓前狀態(tài)基因多態(tài)性會導(dǎo)致血栓出現(xiàn)，進而引起流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局。