抗菌肽的綠色制備及在糧食貯藏方面的應用研究

趙云淼 何靜 張麗君 吳倩倩 張進 孫靜

摘要：本研究旨在對解淀粉芽孢桿菌fmbj所產抗菌肽的提取條件進行優化，通過米糠提取抗菌肽以提高發酵液中抗菌肽的效價。通過單因素試驗對發酵條件如米糠添加比例、吸附時間、溫度、pH進行了優化，優化后的提取工藝為米糠添加比例100 g/L、吸附時間30 min、溫度為65℃、pH為4，期望將抗菌肽產品應用于糧食貯藏，提高糧食保鮮率。

關鍵詞：抗菌肽;制備;糧食貯藏

抗菌肽是一類具有抑菌活性的多肽類物質。它具有抑菌譜廣、穩定性好以及安全性高等特點[1]。截止目前，抗菌肽數據庫收錄種類高達3180種。其中，動物來源占74.09%;植物來源占11.07%;微生物來源占12.20%。與動物源抗菌肽相比，微生物源抗菌肽具有發酵周期短、成本低、可大規模生產的優點，因此，其具有良好的工業化生產前景[2]。

米糠為稻谷和粟米等的加工副產物，主要由種皮、外胚乳、糊粉層和胚組成。我國米糠資源產量巨大，居世界之首。米糠富含油脂、蛋白質、礦物質、維生素等多種營養素和生育酚、脂多糖、谷維素、二十八烷醇、α-硫酸鋅、角鯊烯、神經酰胺等多種天然抗氧化及生理活性物質[3]。然而，我國的米糠主要用于動物飼料，僅有少量用于食用產品制備，資源利用率相比美國、日本等國家偏低。因此，米糠作為一種廉價但是營養豐富的稻谷加工副產物就具有廣闊的利用前景[4]。

本研究優化了用米糠提取抗菌肽的條件，并對不同處理進行多重比較，以探究米糠綠色制備抗菌肽的最佳工藝，提高資源的利用率，并將抗菌肽產品用于糧食的貯藏，提高糧食保鮮率，使糧食貯藏更加安全環保。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生產菌株

解淀粉芽孢桿菌fmbj（CGMCC 0943），保藏于南京農業大學食品科學技術學院酶工程實驗室。

1.1.2 培養基

LB培養基：胰蛋白10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，采用蒸餾水定容至1000 mL，調節pH至7.0，121℃滅菌20 min，備用。

發酵培養基：葡萄糖20 g、L-谷氨酸5 g、酵母浸膏1 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸銅0.15 mg、硫酸鐵1.2 mg、硫酸錳5 mg，采用蒸餾水定容至1000 mL，調pH至7.0，121℃滅菌20 min，備用。

種子培養基：牛肉浸膏3 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，采用蒸餾水定容至1000 mL，調pH至7.0，121℃滅菌20 min，備用。

1.1.3 試劑

胰蛋白胨（上海必優生物科技有限公司）、酵母提取物（上海麥克林生化科技有限公司）、葡萄糖（國藥集團化學試劑有限公司）、L-谷氨酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、牛肉浸膏（國藥集團化學試劑有限公司）、甲醇（上海泰坦科技股份有限公司）等。

1.1.4 主要實驗儀器

高壓蒸汽滅菌鍋（冰山松洋生物科技有限公司）、pH計（奧豪斯儀器有限公司）、低溫冷凍離心機（上海耐圣卡蘭實業有限公司）、高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（國華儀器制造有限公司）、振蕩培養箱（南京賽百傲生物科技有限公司）、電熱恒溫培養箱（南京賽百傲生物科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌fmbj的培養

將解淀粉芽孢桿菌fmbj在LB平板上進行劃線，放入37℃培養箱中培養12 h。挑取活化好的單菌落，接入到種子培養基中，37℃、180 rpm搖床振蕩培養24 h。將種子液接種到發酵培養基中，接種量為5%，置于33℃、180 rpm振蕩培養72 h，發酵后的菌液8000 rpm離心20 min得發酵液上清。

1.2.2 抗菌肽的提取與檢測

準確量取20 mL發酵液上清，用1 mol/L HCl溶液將pH調至2.0，置于4℃冰箱中過夜;將過夜后的發酵液在8000 rpm、4℃條件下離心20 min，棄上清取沉淀;取1 mL的甲醇溶解沉淀物進行萃取，4℃靜置過夜，10000 rpm、4℃離心2 min，棄沉淀，獲得抗菌肽粗提物，然后采用0.22 μm的有機濾膜過濾后置于安培瓶中，置于4℃待測。采用高效液相色譜測定[5]，色譜柱為C18柱（Eclipse XDB，5μm 4.6×250 mm，安捷倫科技有限公司）;進樣量為20 μL，柱溫40℃，檢測波長225 nm。其中流動相A為含0.1%三氟乙酸的水，流動相B為含0.1%三氟乙酸的乙腈，具體的檢測條件參照Qian等的進行[6]。

1.2.3 單因素試驗提取條件

米糠添加比例的確定：按照初始提取條件pH 7.0、吸附溫度45℃、吸附時間90 min，在此基礎上考察不同添加比例（20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120g/L和140g/L）對抗菌肽提取率的影響。

吸附時間的確定：按照初始提取條件pH 7.0、吸附溫度45℃、添加比例60 g/L，在此基礎上考察不同提取時間（30 min、60 min、90 min、120 min和150 min）對抗菌肽提取率的影響。

吸附溫度的確定：按照初始提取條件pH 7.0、吸附時間90 min、添加比例60 g/L，在此基礎上考察不同吸附溫度（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃和75℃）對抗菌肽提取率的影響。

pH的確定：按照初始提取條件溫度45℃、吸附時間90 min、添加比例60 g/L，在此基礎上考察不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）對抗菌肽提取率的影響。

初始提取條件為：pH 7.0、吸附溫度45℃、吸附時間90 min、米糠添加比例60 g/L。

除單因素為變量外，其余提取條件不變，每個實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 米糠添加比例對抗菌肽提取率的影響

由圖1可知，在發酵液上清中添加不同比例的米糠對抗菌肽提取率有顯著的影響。當米糠的添加量在20 g/L-100 g/L的范圍內，發酵液上清中抗菌肽提取率隨著米糠添加量的增加而提高;其中以米糠的添加量在20 g/L-60 g/L時，發酵液上清中抗菌肽提取率增幅最大;米糠的添加量在100 g/L-140 g/L時，抗菌肽的提取率未出現顯著變化。由此可確定米糠添加比例為100 g/L時抗菌肽的提取率最高。

2.2 吸附時間對抗菌肽提取率的影響

由圖2可知，米糠在發酵上清液中吸附時間的不同對抗菌肽的提取率影響顯著。當吸附時間在30 min - 60 min的范圍內，發酵液上清中抗菌肽提取率隨著吸附時間的增加而降低;當吸附時間在60 min - 120 min的范圍內，發酵液上清中抗菌肽提取率隨著吸附時間的增加而提高;其中以吸附時間在60 min - 90 min時，發酵液上清中抗菌肽提取率增幅最大;以吸附時間在90 min - 120 min時，發酵液上清中抗菌肽提取率增幅緩慢;當吸附時間在120 min - 150 min的范圍內，發酵液上清中抗菌肽提取率隨著時間的增加而降低。可以看出當吸附時間為30 min和120 min時，抗菌肽提取率都接近70 %，在減少資源消耗的情況下，可以確定吸附時間30 min為最優提取條件。

2.3 吸附溫度對抗菌肽提取率的影響

由圖3可知，在發酵液上清中吸附溫度的不同對米糠提取抗菌肽有著顯著影響。當吸附溫度在25℃ - 45℃ 的范圍內，發酵液上清中抗菌肽提取率變化不顯著;當吸附溫度在45℃ - 65℃的范圍內，米糠提取發酵液上清中抗菌肽隨著吸附溫度的增加而提高;其中以吸附溫度在45℃ - 55℃ 時，抗菌肽的提取率增幅最大;當吸附溫度在65℃ - 75℃ 的范圍內，米糠對抗菌肽的提取率隨著溫度的增加而降低。由此可確定吸附溫度為65℃ 時抗菌肽的提取率最高。

2.4 pH對抗菌肽提取率的影響

由圖4可知，pH的不同顯著影響米糠對抗菌肽的提取率。隨著pH的升高，發酵液上清中抗菌肽的提取率大體呈下降趨勢，當pH在4-7的范圍內及在8-9的范圍內，發酵液上清中抗菌肽提取率下降趨勢明顯;當pH在7-8范圍內，發酵液上清中抗菌肽提取率無顯著變化。可以看出pH值越小越有利于抗菌肽的提取，而在pH=4時提取率已高達96%，則可選取pH=4為最佳提取條件。

3 結語

根據米糠提取解淀粉芽孢桿菌fmbj（CGMCC 0943）所產抗菌肽的提取條件進行的單因素實驗表明，添加比例100 g/L、吸附時間30 min、提取溫度65℃、pH=4時提取率最高。本文只通過單因素實驗對提取條件進行了優化，后期仍需在此基礎上進行PB實驗，以篩選出影響提取率的主要因素，通過響應面實驗確定最優提取條件。在最優條件下進行抗菌肽的提取，以低成本、高效率的方式得到綠色環保的抗菌肽產品，可作為添加劑應用在糧食儲藏中，通過抗菌肽對霉菌的抑制作用，延長糧食的保存期。

參考文獻：

[1] 王志新， 魯雷震， 周景波， 封成玲， 賈紫偉， 寧亞維， 賈英民. 抗真菌肽研究進展[J]. 生物技術通報， 2021， 37（03）： 206-218.

[2] 王永強. 解淀粉芽孢桿菌SDTB009的分離鑒定及其對番茄枯萎病的防治研究[D]. 山東農業大學， 2020.

[3] 趙菁. 稻米油加工安全性評價[D]. 武漢輕工大學， 2018.

[4] 鄢宏浩， 蔡喬宇， 陳軒， 沈汪洋， 黃文晶. 米糠多糖的提取純化及生理功能活性研究進展[J]. 食品科技， 2020， 45（10）： 197-201.

[5] 吳希， 鄧勤， 徐志勇， 岑舉人， 徐靜. 制備型高效液相色譜在天然產物分離中的應用[J]. 化學分析計量， 2017， 26（01）： 113-117，122.

[6] Qian S， Lu H， Meng P， Zhang C， Lv F， Bie X， Lu Z. Effect of inulin on efficient production and regulatory biosynthesis of bacillomycin D in Bacillus subtilis fmbJ[J]. Bioresource Technology， 2015， 179： 260-267.