林可霉素發酵培養基原材料替代

丁立波

摘要：通過使用當地易得的農副產品替代搖瓶培養基中的低溫黃豆餅粉，接種后培養檢測發酵最終的效價，在亞麻粕、高粱蛋白粉、葵粕中優選出葵粕具有替代的可行性。結果表明在發酵生產中使用有機氮源葵粕按0.95：1比例替代配方中的低溫黃豆餅粉，可提高林可霉素A效價2.2%，原材料成本每月可節約50.7萬元。尤其可大幅提高最終成品質量，發酵液中降低雜質林可霉素B效價24.1%。

關鍵詞：林可霉素、培養基、有機氮源

林可霉素為林可酰胺類抗生素，是由林可酰胺（Lincosamide，LSM）和丙基輔氨酸（Propylproline，PPL）兩部分縮合后修飾而成，丙基輔氨酸是由L-酪氨酸合成而來[1]。實際生產中也需要使用大量的低溫黃豆餅粉補加，來補充發酵培養過程中的有機氮源，供菌體生長及產抗利用。通過使用本地較豐富、價格低廉的高粱蛋白粉、亞麻籽粉、葵粕按照粗蛋白含量等量換算替代基礎培養基中的低溫黃豆餅粉從理論上是可行的。

1.材料與方法

1.1.菌種

林可霉素生產菌林肯鏈霉菌（菌LK20-14）由寧夏泰益欣生物科技有限公司菌種中心提供。

1.2.培養基

1）斜面培養基（%，W/V）：低溫黃豆餅粉0.62，淀粉2.1，KNO32，NaCl0.06，K2HPO40.06，MgSO4·7H2O0.06，FeSO4·7H2O0.002，pH7.0～7.5;

2）搖瓶種子培養基（%，W/V）：低溫黃豆餅粉2，淀粉2.1，葡萄糖1.1，（NH4）2SO40.2，CaCO30.5，pH7.0;

3）搖瓶發酵培養基：發酵培養基（%，W/V）：低溫黃豆餅粉3.1，葡萄糖10.5，玉米漿0.32、（NH4）2SO40.82，NaCl0.60，K2HPO40.02，NaNO30.82，CaCO30.81，pH7.0，

1.3.實驗方法

1）斜面培養：玻璃棒沾取菌懸液，在斜面培養基涂抹均勻，培養溫度29～31℃，相對濕度16%～24%的環境下倒置，培養7～8d。

2）搖瓶種子培養：從斜面挑取單菌落接種搖瓶，培養基裝量30mL/300mL三角瓶，培養溫度29～31℃，相對濕度15%～25%，搖床轉速220r/min條件下培養48～52h。

3）搖瓶發酵培養：待種子到培養周期后，將種子接入發酵搖瓶，培養基裝量35mL/300mL三角瓶，培養溫度29～31℃，相對濕度15%～25%，搖床轉速220r/min條件下培養72h。

4）放大培養：150kL機械攪拌發酵罐，29.5～30.5℃、罐壓0.025～0.035MPa、接種量40%培養。

2.實驗結果

2.1.低溫黃豆餅粉替代物的優化選擇

低溫黃豆餅粉為有機氮源，含有豐富的粗蛋白、有機磷，本次實驗選用的三種替代物料依據粗蛋白含量計算替代物使用量，其中高粱蛋白粉、葵粕（浸提）按1：1量替代，亞麻粕1.3：1替代相應比例的低溫黃豆餅粉。綜合發酵單位及成本，葵粕（浸提）市場供應充足、價格低廉、替代后發酵單位林可霉素A組分較好。選定葵粕（浸提）為最佳低溫黃豆餅粉替代原材料。

2.2.葵粕最佳替代比例確定

由粗蛋白含量確定替代比例，但某些氨基酸及維生素含量差異需要實驗不同比例替代對發酵單位的影響，實驗驗證全部替代低溫黃豆餅粉所需的葵粕量，由下圖可以看出，當葵粕的替代比例為0.95：1時，發酵單位可達到最高，觀察搖瓶菌絲形態及發酵液離心濕重均正常。確定最佳替代比例葵粕：低溫黃豆餅粉為0.95：1。

2.3.150kL發酵罐大生產放大實驗

為檢驗搖瓶實驗結果在發酵大生產中的效果，依據搖瓶替代比例，在發酵生產中按0.95：1使用葵粕替代四級發酵罐培養基中的低溫黃豆餅粉，連續進十批實驗驗證。

從表4可以看出，替代后的平均發酵單位A組分效價較未替代前的平均單位高2.2%，使用葵粕較低溫黃豆餅粉價格成本低，月可為車間節約50.7萬元。產品質量有較大提升，其中B組分效價替代后有較大幅度下降，發酵放罐B組分下降24.1%。

3.討論

由表1葵粕的粗蛋白含量與低溫黃豆餅粉含量相同，通過粗蛋白含量等量換算可以有效替代有機氮源，因其中氨基酸和其他物質含量的不同，對林可霉素發酵單位有不同影響，需要適當調整替代比例，最佳替代比例為0.95：1。

林可霉素生物合成中的所有甲基化作用均以甲硫氨酸作為甲基供體，在蛋氨酸腺苷轉移酶的催化下，蛋氨酸與ATP作用，生成S腺苷蛋氨酸（SAM）。SAM中的甲基十分活潑，稱活性甲基，SAM稱活性蛋氨酸。SAM在甲基轉移酶的催化下，可將甲基轉移給另一物質，使甲基化[3][4]。葵粕蛋氨酸及膽堿含量相對低溫黃豆餅粉較高，為林可霉素A生物合成中三個甲基化步驟提供了較多的甲基供體。本次使用葵粕替代即降低了發酵罐培養基的物料成本，又降低了雜質組分林可霉素B的含量。

參考文獻

[1]劉瑞華.林可霉素生物合成的研究進展[J].微生物學通報，2018，45（05）：1138-1145.

[2]中國飼料數據庫.FeedStuff（2017）常規飼料成分[EB/OL].http：//www.chinafeeddata.org.cn/picture/pdf/CFICout2017_1.pdf

[3]Ushimaru R，Lin CI，Sasaki E，et al.Characterization of enzymes catalyzing transformations of cysteine S-conjugated intermediates in the lincosamidebiosynthetic pathway[J].ChemBioChem，2016，17（17）：1606-1611

[4]Hou BB，Lin YW，Wu HZ，et al.The novel transcriptional regulator lmbU promotes lincomycin biosynthesis through regulating expression of its target genes in Streptomyces lincolnensis[J].Journal of Bacteriology，2018，200（2）：e00447-17