不同基因型鵝星狀病毒鑒別診斷RT-PCR方法的建立

王宏宇， 朱寅初， 云濤， 華炯鋼， 葉偉成， 倪征， 陳柳， 張存

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021； 2.南京農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

2014年在我國湖南首次報道發(fā)現(xiàn)鵝星狀病毒(Goose astrovirus，GAstV)，隨后在遼寧、山東、江蘇、安徽乃至廣東等主要養(yǎng)鵝省份均陸續(xù)出現(xiàn)以內臟痛風為典型臨床癥狀的傳染病，經(jīng)分離鑒定，病原為星狀病毒，且基因組序列有別于湖南發(fā)現(xiàn)毒株[1-3]。當前證據(jù)顯示，該病主要可導致5～20 d齡雛鵝發(fā)病，患病雛鵝表現(xiàn)為精神沉郁，臥地不動，采食下降甚至死亡，剖檢可見心臟和肝臟表面明顯的粉末狀白色尿酸鹽沉積，腎臟腫大壞死[4]。流行病學調查顯示，近年來該病造成的死亡率由最初的5%逐漸上升，最高可達50%，給我國養(yǎng)鵝業(yè)帶來嚴重危害，造成巨大經(jīng)濟損失[5]。

鵝星狀病毒基因組分析顯示，其為單股正鏈無囊膜RNA病毒，基因組全長約7～8 kb，兩側為5′UTR和3′UTR(具PolyA尾)，包含ORF1a、ORF1b和ORF2 3個開放閱讀框(ORF)[6-8]。ORF1a編碼多種非機構蛋白；ORF1b序列與ORF1a存在重疊，編碼保守的RNA依賴性RNA聚合酶(RbRp)；ORF2為病毒結構蛋白，包裹病毒外表面，形成衣殼和纖突結構。隨著越來越多病毒基因組的測序顯示，已報道的鵝星狀病毒存在兩種基因型，核酸序列差異大，臨床調查顯示單一和混合病毒感染等多種情況均有出現(xiàn)；鑒于當前鵝星狀病毒的致病機制尚不清楚，感染情況復雜，因而對該病毒的及時檢測發(fā)現(xiàn)對后期防控尤為重要。在實際病原鑒定中針對一種基因型的鵝星狀病毒的PCR檢測不僅目標樣本單一，而且操作工序復雜，成本高，費時費力，因而本試驗根據(jù)GenBank公布的GAstV 編碼RbRp的基因序列設計特異性引物，嘗試建立雙重一步法RT-PCR檢測體系，可直接以RNA為模板，并達到同一體系檢測不同基因型鵝星狀病毒的目的，為臨床混合感染和流行病學調查提供快速有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2017—2020年，共采集來自浙江和江蘇共73份雛鵝及鵝胚樣本，全部樣品記錄品種、日齡、組織、地點等信息，并于-80 ℃冰箱保存。鴨瘟[9](Duck plague virus，DPV)、鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)、坦布蘇病毒[10](Goose-origin tembusu virus，GTMUV)、鵝呼腸孤病毒[11](Goose-origin reovirus muscovy duck reovirus，GRV)、H9N2亞型禽流感病毒(Avain influenza virus，AIV)均由本實驗室保存。磁珠法病毒RNA抽提試劑盒購自濟帆科技生物有限公司。TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0和DNA Marker 5000為TaKaRa公司產(chǎn)品；HiScript II One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)為Vazyme公司產(chǎn)品；Plasmid Mini Kit為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)布的兩種不同序列的GAstV病毒基因序列，選取RdRp保守序列區(qū)域利用Oligo 7.0軟件分別設計兩對特異性引物，用于擴增對應GAstV病毒，引物由鉑尚生物技術公司合成(表1)。

表1 試驗引物的基本情況

1.3 PCR擴增

單一RT-PCR分別以對應的鵝星狀病毒作模板擴增，建立20 μL體系：2×One Step Mix 10 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各1 μL，RNA模板1 μL。反應條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，35個循環(huán)，72 ℃ 7 min，4 ℃保存擴增產(chǎn)物；經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，測序鑒定。

對雙重RT-PCR反應的引物、模板等用量，退火溫度等參數(shù)設置梯度，通過優(yōu)化和多次重復實驗后，確定最佳反應體系，同時設置陰性對照。PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析鑒定。

1.4 雙重RT-PCR特異性試驗

根據(jù)建立并優(yōu)化的多重PCR方法對水禽常見病毒包括GTMUV、GPV、MDRV、DPV和AIV進行檢測，以鑒定其特異性。

1.5 敏感性試驗

使用目的片段所在基因的克隆載體作為陽性質粒，用NanoDrop測定核酸濃度，計算陽性質?？截悢?shù)。其后將質粒模板進行10倍梯度稀釋，并以優(yōu)化條件進行多重PCR敏感性測試。

1.6 穩(wěn)定性試驗

用建立的雙重RT-PCR方法間隔一周對樣本重復檢測，每次不同濃度設置3個重復，連續(xù)檢測3次后，以驗證此PCR方法的可靠性和穩(wěn)定性。

1.7 臨床樣本應用試驗

將實驗室在周圍地區(qū)養(yǎng)殖場采集和送檢的病死鵝及鵝胚等樣本73份進行核酸提取，應用建立的雙重RT-PCR方法對其進行檢測，并用單一的PCR方法進行復檢比較，以檢驗此方法在實際應用中的效果。

2 結果與分析

2.1 單片段擴增

根據(jù)已經(jīng)公布的新型鵝星狀病毒全基因組序列，進化分析顯示其可分為兩個基因型，Group Ⅰ和GroupⅡ，且兩者序列差異較大(圖1)。單一引物PCR結果顯示，各引物可有效擴增出目的基因，條帶單一清晰，條帶大小與預期相符，彼此間序列不產(chǎn)生交叉，測序結果比對證實為鵝星狀病毒編碼RdRp基因序列，大小分別為Ⅰ型441 bp，Ⅱ型為277 bp(圖2)，適合鵝星狀病毒的檢測及分型鑒定。

圖1 鵝星狀病毒RbRp核酸序列進化樹

M—DL1000；Ⅰ—基因Ⅰ型；Ⅱ—基因Ⅱ型；N—陰性對照；A—Ⅰ型核酸樣本；B—Ⅱ型核酸樣本。

2.2 雙重RT-PCR檢測方法的優(yōu)化

通過設置不同退火溫度及引物混合濃度等參數(shù)的比較試驗，根據(jù)擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠成像結果條帶明暗度、清晰度，分析得出退火溫度在50～54 ℃皆可，適宜引物濃度GastV Ⅰ和Ⅱ各為1 μmol·L-1(圖3～4)。最終擴增程序為50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

M—DL1000；1—0.25 μmol·L-1；2—0.5 μmol·L-1；3—1 μmol·L-1；4—2 μmol·L-1；N—陰性對照。

M—DL1000；1—50 ℃；2—52 ℃；3—54 ℃；4—56 ℃；5—58 ℃；6—60 ℃；N—陰性對照。

2.3 PCR方法特異性

采用優(yōu)化后的雙重RT-PCR反應條件，對不同鵝星狀病毒、鵝細小病毒、禽流感病毒、坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、鴨呼腸孤病毒進行檢測，結果顯示，該引物只能擴增出星狀病毒相應的目的條帶，條帶清晰，其他對鵝常見病毒種類和陰性對照未見擴增產(chǎn)物(圖5)。上述結果表明，該雙重RT-PCR方法有良好的特異性。

M—DL1000；1—GastV；2—TMUV；3—GPV；4—MDRV；5—DPV；6—AIV；N—陰性對照。

2.4 敏感性

對10倍稀釋的陽性核酸樣本進行PCR檢測，再根據(jù)前期公式計算的拷貝數(shù)換算，最終結果顯示，所建立的雙重RT-PCR方法對GAstV Ⅰ型和Ⅱ型的的最低檢測模板量分別為103和102拷貝(圖6)。

M—DL1000；A—Ⅰ型單一PCR敏感性；B—Ⅱ型單一PCR敏感性；C—雙重PCR敏感性；1～9—109～101拷貝·mL-1。

2.5 重復性檢測

應用此雙重RT-PCR檢測方法，間隔一周對同一模板進行反復檢測，共重復3次，每次3個重復，并設置陰性對照。結果顯示，多次試驗結果一致，表明所建立的PCR方法具有較高的穩(wěn)定性和可重復性。

2.6 臨床樣本的檢測應用

利用上述建立的雙重RT-PCR方法對江浙數(shù)個養(yǎng)殖場采集到的病樣進行檢測，結果表明，73份病樣中有68份為鵝星狀病毒陽性，陽性率93.2%(圖7)；其中GAstV Ⅰ型和Ⅱ型均陽性的有5份，而GAstV Ⅱ型單獨存在的有63份，GastV Ⅰ單獨存在的陽性樣本則只有一個。該結果與單一PCR檢測結果完全相同。

M—DL1000；1～14—臨床樣品；N—陰性對照。

3 討論

鵝星狀病毒作為新發(fā)疫病病原，近年已給各地養(yǎng)鵝業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。當前在我國多地區(qū)雛鵝群中出現(xiàn)流行，臨床暴發(fā)痛風；在排除飼料和環(huán)境等問題后，明確了雛鵝痛風的主要病因是由鵝星狀病毒感染引起[12]。病毒基因組序列同源性分析顯示，臨床鵝星狀病毒主要存在兩種不同基因型分離株，且兩種病毒核酸序列差異較大，但都屬于星狀病毒成員，感染宿主主要為20 d齡雛鵝；分別為以FLX株為代表的Group Ⅰ型和以GD株為代表的Group Ⅱ型，而這兩種毒株也呈現(xiàn)混合感染現(xiàn)象，至今尚不清楚兩種基因型病毒的各自致病機理。傳統(tǒng)的病毒分離、電鏡觀察鑒定、血清學試驗等病毒檢測方法費時費力，操作難度高，特異性差；準確快速的診斷技術在病原體鑒別診斷上應用價值較大，尤其是對于混合感染。雖然已有研究人員建立了GAstV的PCR檢測方法[13]，但都是針對單一基因型病毒的檢測，存在操作煩瑣、不能同時檢測到兩種基因型病毒的不足。而鵝星狀病毒作為新發(fā)病原，對其研究甚少，不同毒株及其致病機制尚不清楚，因此，建立快速檢測該病毒感染并且可區(qū)分基因型的方法，將有利于防控該病。

兩種基因型鵝星狀病毒基因組均由3個開放閱讀框組成，ORF1a、ORF1b和ORF2，分別主要編碼絲氨酸蛋白酶、RNA依賴性RNA聚合酶和衣殼蛋白。本研究選取其RNA依賴性聚合酶區(qū)域基因序列作為檢測靶基因，設計特異性引物，建立的一步法RT-PCR方法，操作簡單，可實現(xiàn)以RNA為檢測模板，在反應體系中完成RNA反轉錄并擴增。經(jīng)對反應體系和條件的摸索優(yōu)化后，敏感性高，最低可檢測出103拷貝的星狀病毒；特異性好，條帶單一，不會因其他RNA病毒而受到干擾，產(chǎn)物可回收測序。應用所建立的一步法RT-PCR檢測方法對臨床收集到的73份樣本進行測試，發(fā)現(xiàn)本次樣品中仍以Ⅱ型病毒更為普遍，是優(yōu)勢毒株；Ⅱ型病毒與Ⅰ型共同感染的情況也存在，發(fā)現(xiàn)5例，占檢測總數(shù)6.8%；僅發(fā)現(xiàn)一例Ⅰ型病毒單一感染情況，這與已有研究報道的情況相符合[14-17]。結合其他學者的流行病學調查顯示，不同地區(qū)病毒感染情況存在差異，部分地區(qū)主要以混合感染為主，其樣品中混合感染可達94.03%[18]，值得引起重視。此外，報道顯示兩種基因型GAstV分離株都有致病能力，可致鵝胚死亡，并有明顯病變，因而對GAstV應加以重視。本研究建立的方法快速、靈敏、特異且穩(wěn)定，操作簡單，設備要求低，將為GAstV臨床診斷和早期流行病毒調查提供快捷可靠的技術手段。