煤矸石充填復墾土壤細菌群落變化

焦 赫，李新舉

(1.山東農業大學 資源與環境學院，山東 泰安 271018； 2.土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東 泰安 271018)

高潛水位煤礦區煤炭開采常造成嚴重的地面沉降，多年來一直采用回填復墾技術來減輕沉降影響[1-2]。煤矸石因為價格低廉且長期堆放會對地表結構和生態環境造成嚴重破壞，而被廣泛用作礦區沉陷土地充填材料[3-4]。然而煤矸石作為固體廢棄物，養分含量低，且含有較多重金屬元素，其充填后的耕地質量較低，易造成嚴重的土壤、水和空氣污染等問題[5]。因此，煤矸石充填復墾地土壤質量的研究是國內外相關專家關注的焦點[6-7]。目前，對采煤塌陷地煤矸石充填復墾地的土壤質量研究主要集中于植物保護、重金屬污染、土壤酶活性等方面[8-10]，在煤矸石充填復墾對土壤微生物生態影響的研究較缺乏。

土壤微生物參與了土壤生態系統中的物質循環、信息傳遞以及能量轉換，在養分的轉化循環、維持生態系統穩定性和植被演替恢復中起著決定性作用[11-14]。細菌作為土壤地下和地上系統交流的重要媒介，參與了土壤生態系統中大多數養分的循環轉化，是推動植物凋落物和土壤有機質分解的重要驅動力[15]。其中，土壤細菌群落被認為是生物地球化學循環、氣候調節或植物生產力等土壤功能的關鍵參與者[16]，對土壤物理化學性質、植被類型和水文變化等環境因素變化敏感[17-18]。因此，土壤細菌群落組成和結構變化常被用來反映土壤環境質量的變化。

研究表明，土壤細菌群落組成和結構的變化是退化土壤環境恢復效果的重要反映，包括濕地生態恢復、退化森林治理、鹽堿地修復[19-21]。此外，土壤細菌群落在衡量礦區復墾土壤質量和生態效益方面具有重要作用。王瑾[22]研究發現土壤細菌群落對不同復墾時間、不同破壞程度、不同復墾區域的采煤沉陷復墾土壤響應不盡相同。KNELLER等[23]通過研究采礦區不同復墾技術下土壤細菌等微生物對于土壤外源有機質添加后的反映，發現細菌群落在評估礦山土壤質量恢復效果的過程中起著關鍵指示作用。郭曉明等[24]研究礦區沉陷復墾地土壤細菌數量及酶活性空間分布特征發現，與非沉陷地相比，沉陷區對土壤細菌群落的生長存在一定抑制作用，采煤沉陷導致耕地土壤細菌數量空間異質性顯著增加。李兆龍等[25]在銅尾礦應用土壤細菌解釋了土壤微生物群落結構對重金屬污染的響應，證明細菌等微生物對礦區退化土壤進行生態修復評估的重要價值。LI等[26]研究了黃土高原西北部露天煤礦復墾區土壤微生物豐度和多樣性，說明細菌等微生物群落演替對于不同復墾方案的響應敏感程度存在顯著差異。由此可見，土壤細菌及其群落在礦區采煤沉陷復墾領域的傳統研究較為廣泛。然而在高潛水位礦區，煤矸石充填復墾作為主要的復墾方式之一，目前利用現代高通量測序方法研究煤矸石充填后土壤細菌群落的變化是有限的。

筆者利用高通量lllumina Miseq 16S rRNA測序方法，探討了中國東部典型高潛水位礦區采煤塌陷地煤矸石充填復墾耕地不同土層深度下土壤細菌群落多樣性和結構組成的變化，并分析了特定優勢細菌門與土壤理化性質的關系。主要目的是確定：① 煤矸石充填復墾后土壤性質變化；② 煤矸石充填復墾后土壤細菌群落多樣性和結構組成的差異變化；③ 可能影響細菌群落結構和多樣性的潛在關鍵土壤特性。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于山東濟寧市東灘礦區，地理坐標為35.41°N～116.96°E，總面積約為1 616.56 km2(圖1)。地形以平原為主，作物種類豐富，氣候為四季分明的溫帶大陸季風性氣候，雨量集中，水熱同步。根據美國農業部土壤質地劃分和美國農業部土壤系統分類的數據[27]，研究區域的土壤類型主要為濕潤淋溶土。土壤質地為砂壤土，礫石含量約7.3%。

圖1 研究區位置Fig.1 Location of study area

東灘礦區因常年煤炭開采造成了大面積采煤塌陷地，自2001年開始進行塌陷地的充填復墾。該區充填復墾方式根據充填物的不同主要有煤矸石充填、粉煤灰充填和客土充填等方式。研究區主要采用的典型復墾工藝是煤矸石充填復墾。具體做法是在煤礦區的土地塌陷平穩后，前期先進行表土剝離，然后利用煤矸石進行充填，最后再回填表土層的土壤。復墾規劃設計標高為47.0 m，未復墾土地平均標高約為39.8 m，平均充填矸石厚度約為6.2 m，矸石充填后覆土厚度在60～100 cm[28]。充填煤矸石來源于研究礦區煤矸石山和部分選煤廠矸石，煤矸石以碳酸鹽類和碳質砂巖為主，其風化物以礫石為主，顆粒間差異較大。由于早年復墾過程中多次受到機械壓實，土壤較為緊實。復墾后的利用方式主要為耕地、種植小麥、玉米等作物。

1.2 樣品采集

2018年8月，按照室內設計路線，在試驗區設置3個16 m×16 m的樣地(3個重復)，在每個樣地內，采用直徑5 cm的土壤螺旋鉆，用對角線取樣法和環刀法分3層(0～20，20～40，40～60 cm)于5個點均勻采樣，并以周邊正常耕地作為對照。每層土樣采集5份并均勻混合，質量約2 kg，且每層取1 kg環刀樣，用于土壤含水量和容重的測定，所有樣品均裝入無菌保鮮袋放置鋪滿冰袋的保溫箱中，立即運回實驗室。除去環刀樣，將其他土樣中明顯的植物殘渣、石子磚塊去除后，按照四分法，將每層所取5份土樣均勻混合，每個樣品的一半經風干研磨并過2 mm的篩子，儲存在室溫下用于化學和物理性質分析；另一半立即放置-80 ℃下冷凍用于微生物分析。

1.3 土樣理化性質

把土樣置于鋁制鐵盒中，在105 ℃下烘干48 h，進行土樣含水量(MoiC)測量。容重(BD)采用環刀法測定。采用高溫外加熱重鉻酸鉀氧化-容重法測定土壤有機碳(SOC)含量。用pH計(PHSJ-3F)和TDR(TRIME-IPH)測定土壤中的pH和電導率(EC)。分別用凱氏法測定堿解氮(AN)、奧爾森法測定速效磷(AP)、用鹽酸銨萃取后用原子吸收光譜法測定速效鉀(AK)。對上述指標均進行了3次重復測試，并根據相關性做進一步分析。

1.4 土壤細菌16S rRNA基因序列分析

1.4.1DNA抽提和PCR擴增

根據制造商說明，使用E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書從每種土壤樣品中稱取0.5 g進行總DNA抽提。DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用引物515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因V5-V6可變區進行PCR擴增。擴增程序為：94 ℃預變性10 min，35個循環(94 ℃，變性40 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸90 s)，最后72 ℃延伸10 min (PCR采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase;PCR儀:ABI GeneAmp?9700型)。擴增體系為24 μL，18.35 μL 水，2.5 μL 10×buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，各0.5 μL引物(515F和806R)，0.15 μL Taq聚合酶，1 μL所提取DNA。

1.4.2高通量測序

用2%瓊脂糖凝膠電泳對3個重復PCR產物進行檢測并匯集，然后利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進行純化，并利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)進行檢測定量。最后，根據Illumina MiSeq平臺(Illumina,San Diego,USA)標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。通過高通量測序對所有純化和混合樣本測序讀數進行分析。最終，實驗數據利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

1.5 數據處理和分析

采用SPSS 22.0軟件對土壤性質數據進行單因素方差分析(ANOVA)，在P<0.05時觀察到顯著性。使用R vegan軟件包計算了α多樣性指數，包括豐富度(Ace和Chao指數)、微生物群落多樣性(Shannon指數)。用β多樣性分析評價物種復雜度的差異，利用R vegan軟件包做基于Bray-Curtis差異矩陣的主坐標分析(PCoA)以比較和可視化土壤樣本之間的相似性。為探討細菌群落與土壤性質之間的關系，利用CANOCO 5.0對門水平下前10個優勢菌門與土壤理化性質進行典型相關分析(CCA)，以Pearson相關分析法輔助分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

所考慮的土壤理化性質(AN，AP，AK，SOC，pH，EC，BD，MoiC)在不同處理間差異顯著(表1)。G的pH值分布在8.23～8.68，3層pH均顯著高于CK(P<0.05)，且在深度變化上呈現逐漸降低的變化趨勢。G的EC在不同土層深度下均大于CK，隨土層深度增加而增大。G和CK的EC在DL(Deep Layer)均高于SL(Surface Layer)和ML(Middle Layer)層。G的AN和AK變化趨勢一致，ML和DL土層質量分數(均值為72.85 mg/kg和75.82 mg/kg)遠低于表層(120.67 mg/kg 和108.83 mg/kg)，G的AP質量分數隨土層深度增加呈現下降趨勢。與CK相比，G的AN質量分數(120.67 mg/kg)在SL層略高于CK(120.57 mg/kg)。AK，AP在不同土層深度下質量分數均明顯低于CK。G的SOC質量分數隨土層深度增加呈現逐漸下降趨勢，在SL層與CK質量分數接近，但其他層遠低于CK。G的BD在各層均高于CK，且ML質量分數高于其他土層。整體上G的含水量低于CK。

表1 復墾地和對照地的土壤性質

2.2 土壤細菌群落組成特征

從18個樣品整合的數據集中保留了1 607 790個高質量的序列(細菌群落平均每個樣本89 322個)，共檢測到11 430個OTUs，有效序列長度均>200 bp。G和CK的ACE，Chao和Shannon指數在豐富度和多樣性方面存在顯著差異(表2)。所有樣本的覆蓋率都在96%以上，說明測序讀數足以進行分析。通過對Chao，ACE和Shannon指數在不同土層深度下的計算，結果表明，在SL層，G的豐富度和多樣性略高于CK，但在DL層，G的土壤細菌ACE指數、Chao指數和Shannon指數的最低值分別為1 062，1 090 和4.38，遠低于CK。 ANOVA分析表明，與CK相比，Ace，Chao，Shannon指數在不同土層深度差異顯著(P<0.05)，在DL層，G的Ace，Chao，Shannon指數分別較SL層降低74.44%～80.92%，73.81%～79.90% 和29.93%～41.00%。因此，說明整體上煤矸石充填后的耕地的細菌群落多樣性和豐富度低于CK，且與土層深度呈顯著負相關。PCoA發現，G和CK在不同土層深度下土壤細菌群落組成存在顯著差異(圖2)。

表2 不同處理下觀測到的操作分類單元、覆蓋率、豐富度和多樣性的估計值

圖2 主坐標分析Fig.2 Principal coordinates analysis

在門的水平上，樣品的總體細菌群落組成相似，但觀察到一些樣品的不同比例，如圖3所示，圖3中，不同小寫字母為處理間差異顯著(P<0.05)。在所有樣品中，變形菌門是最豐富的種類，平均相對豐度為32.43%。放線菌門是第2豐富的門，平均相對豐度為17.60%。酸桿菌門的平均相對豐度為14.46%。其他優勢菌門平均相對豐度值按降序排列依次為：綠彎菌門(5.90%)、擬桿菌門(4.75%)、芽單胞菌門(4.53%)、厚壁菌門(3.39%)、浮霉菌門(2.77%)、羅卡氏菌門(2.68%)、疣微菌門(1.49%)、球狀細菌(1.30%)。與CK相比，G的變形菌門和酸桿菌門平均相對豐度值隨土層深度增加呈下降趨勢，變形菌門相對豐度下降了14.13%～24.25%，酸桿菌門相對豐度下降了91.16%～97.41%，而放線菌門呈明顯上升趨勢，相對豐度上升了113.85%～167.17%。優勢菌門相對豐度在CK各土層中變化沒有明顯規律。另外，與自身相比，G的優勢菌門在DL層相對豐度遠低于其他土層。

圖3 細菌門的相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial phyla

2.3 土壤理化性質與土壤細菌群落的相關性

采用CCA方法分別研究了G和CK土壤細菌群落(前10個優勢門的相對豐度)與土壤理化性質(AN，AP，AK，SOC，pH，EC，BD，MoiC)之間的關系(圖4)。研究發現，該區土壤細菌群落的總體結構與pH，MoiC，SOC，AP，AK顯著相關。另外，筆者還計算了G和CK前10個優勢菌門與土壤理化性質之間的皮爾遜系數(Pearson)見表3，4。研究發現，相對豐度較高的優勢菌群(變形菌門、放線菌門和酸桿菌門)僅與土壤某些理化性質顯著相關。在G中，MoiC與變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等優勢菌門相對豐度均呈顯著正相關(P<0.05)。pH與擬桿菌門的相對豐度呈極顯著負相關(P<0.01)，與芽單胞菌門呈顯著正相關(P<0.05)。在CK中，相對豐度較高的前3類優勢菌僅有變形菌門相對豐度與AP呈顯著正相關(P<0.05)。此外，放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、厚壁菌門與大多數土壤理化性質無顯著相關。

表3 煤矸石充填復墾地土壤細菌群落與土壤理化性質的相關系數

圖4 典型相關分析Fig.4 Canonical correspondence analysis

3 討 論

3.1 土壤理化性質變化

G與CK存在顯著差異，不同土層深度下土壤理化性質變化趨勢差異很大。G的AN，AP，AK，SOC在SL層含量高于其他土層，這可能與人工施肥、表土回填有關[29-30]。但從ML層開始，特別是AP，SOC含量隨土層深度增加呈現明顯下降趨勢。這是由于煤矸石養分含量低，充填效果差，導致土壤養分下滲速率變低[31-32]。與CK相比，G的EC在不同土層深度下均大于對照地，且隨土層深度增加而增大，這也與煤矸石充填有關，由于高地下潛水位從底部煤矸石充填區帶來可溶性物質，并逐年隨水分蒸發向上層遷移，導致與煤矸石接觸層的EC明顯高于表層，與前人研究結果[28]類似。研究區復墾地由于早年受機械壓實影響嚴重，較多次數的碾壓破壞了土壤結構[33]，使得土壤緊實，容重增大，深層次土壤群落恢復速率慢，從而影響土壤養分的充分轉化，同時也導致復墾地的MoiC低于普通耕地[34-35]。這些發現表明，充填復墾質量影響土壤養分質量的提高，通過提高煤矸石充填技術和加強土地耕作深翻，將會在穩定土壤生態系統和控制土地退化等方面發揮重要作用。

表4 對照地土壤細菌群落與土壤理化性質的相關系數

3.2 土壤細菌群落組成變化

根據表1的結果，煤矸石充填復墾對OTUs、細菌群落豐富度(ACE和Chao1)和多樣性(Shannon)指數有顯著影響(P<0.05)。在本研究中，煤矸石充填復墾后的總OTUs和細菌多樣性指數(包括ACE，Chao和Shannon)在SL層均增加，但在DL層出現顯著降低。SL層中由于較高的灌水量和施肥量，促進了土壤細菌的生長。此外作物種植也會為土壤細菌提供更多生長營養成分，與前人研究[29-30,36]一致。但由于煤矸石充填質量差，營養成分缺失，在DL層復墾地的土壤多樣性和豐富度驟減。另外，整體上G的土壤細菌群落多樣性是低于CK的，究其原因可能是：一方面，由于煤矸石充填造成土壤肥力下降，影響了有機質和礦物質的分解，抑制了細菌生長和繁殖[31-32]；另一方面，由于研究區屬于高潛水位采煤塌陷地，復墾時間也較長，研究區存在一定鹽漬化威脅，且土壤普遍呈堿性，在一定程度上抑制了細菌活性，導致復墾地土壤細菌群落多樣性較低[37]。

變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是研究區內最具優勢的門，這與前人研究一致[38-39]，說明這些門并不是某一區域特有，不同區域相對豐度不同。在G中觀察到放線菌隨土層深度增加呈現上升趨勢。LI等[40]在研究礦區重金屬污染環境時得出放線菌適合在低營養環境中生長。而酸桿菌的相對豐度隨土層深度下降而降低，在G的DL層觀察到的相對豐度平均值僅有0.7%。這與煤矸石充填質量差，且研究區土壤偏堿性，土壤結構被破壞，進而影響了酸桿菌的生長環境有關[41]。另外，由于煤矸石填充所造成的土層擾動，也令酸桿菌在各個土層的分布遠不及普通耕地平穩[30]。在G和CK的各層均觀察到較高的變形菌門相對豐度。據研究，變形菌在草地[37]、森林[38]和牧場土壤[42]的細菌群落中占主導地位，近年來，變形菌在礦區中也被判斷為優勢菌[38-39]。此外，由于煤矸石充填影響土壤結構穩定和營養輸送，復墾土壤中細菌間的競爭壓力增大，所以G的優勢菌門在DL層相對豐度遠低于其他土層。

3.3 土壤理化性質與土壤細菌群落關系變化

CCA(圖4)和Pearson相關系數(表3，4)顯示了土壤細菌群落與土壤理化性質之間的關系。在本研究中，pH是影響復墾地與對照地土壤細菌群落的主要因素。因為高潛水位特有的水土條件導致土壤存在鹽漬化風險，尤其是研究區的復墾地中充填的煤矸石中又含有大量的碳酸鹽礦物，碳酸鹽礦物溶解后溶液導致土壤呈弱堿性，pH過高，將破壞土壤結構，導致土壤通氣狀況變差，間接影響土壤養分轉化及其有效性[43]。通過圖4可以看出，在煤矸石充填復墾地中，MoiC和SOC是影響細菌群落結構的主要理化性質。已有研究證明煤矸石結構性差，大孔隙多，毛細孔隙少，土壤保水能力差[44]。而煤矸石充填復墾土壤會影響含水量的下滲速率，抑制細菌等微生物活躍度，進而影響細菌群落相對豐度穩定性[32]。研究發現，煤矸石充填復墾地的SOC是細菌群落能量和營養物的穩定來源，細菌分解代謝速率與SOC含量相關。尹寧寧等[45]在研究礦區SOC與土壤微生物功能多樣性之間關系時也有同樣的結論。另外，AP和AK是影響對照地土壤細菌群落結構的主要理化性質。長期施肥效應對細菌群落的影響不容忽視，AP的施用能增加土壤細菌多樣性以及各細菌物種在群落中分布的均勻性[46]。而鉀肥的生物可用性一直被認為是調節農田生態系統產量的關鍵因素，PENG等[47]的研究中發現AK是影響油菜籽根際微生物群落的重要因子。也有研究認為AK含量與農田黑土細菌各細菌群落生物量呈高度正相關[48]。

根據Pearson相關分析結果，發現變形菌門與AP存在顯著相關性(P<0.05)，說明變形菌門具有嗜營養的特點[10]。芽單胞菌門具有抗極端環境條件和清除土壤中重金屬的能力，能適應堿性土壤環境，與復墾地pH呈正相關[30]。而擬桿菌門因為不能適應堿性環境與pH呈負相關[49]。另外，MoiC與復墾地中變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等優勢菌門的相對豐度均呈顯著正相關，這與煤矸石填充土壤保水能力差，影響細菌群落生長繁殖有關[44]。此外，優勢菌門僅與部分理化性質顯著相關(P<0.05)，放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、厚壁菌門對大多數土壤理化性質的變化無明顯響應。

4 結 論

(1)由于受煤矸石自身特性及高潛水位特有的水土條件影響，煤矸石充填復墾地的土壤細菌群落多樣性與豐富度低于普通耕地，且隨土層深度增加呈顯著下降趨勢，40～60 cm土層細菌群落多樣性與豐富度明顯低于其他土層。

(2)煤矸石充填復墾地土壤細菌群落組成與普通耕地有很高的相似性，在不同土層深度下，土壤細菌群落結構的變化主要體現在優勢菌群落比例的變化。在所有的處理中，優勢菌門是變形菌門、放線菌門和酸桿菌門。與對照地相比，復墾地表層的優勢菌相對豐度較高，但經過煤矸石充填復墾工程擾動后，土壤生態環境受到嚴重影響，尤其在40～60 cm層，細菌等微生物難以在煤矸石層正常生長，細菌群落組成差異變大。

(3)煤矸石充填復墾顯著改變了研究區土壤理化性質，不同土層深度下土壤理化性質變化趨勢差異明顯。相關性分析表明，pH，MoiC，SOC，AP和AK是影響土壤細菌群落組成的主要土壤理化性質。但部分優勢菌門對理化性質的響應并不明顯，可能與土壤微生物群落的高度復雜性及該區域條件的特殊性等多方面因素相關。