一種應(yīng)用鐮刀菌酸快速鑒評(píng)瓜類枯萎病抗性的方法

和婷婷，張長(zhǎng)遠(yuǎn)，林毓娥，謝大森，張曉愛，金慶敏，王瑞娟，姚春鵬

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，廣東 廣州 510640；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】由尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）引發(fā)的枯萎病已成為影響瓜類產(chǎn)量和品質(zhì)、制約瓜類產(chǎn)業(yè)綠色高質(zhì)量發(fā)展的嚴(yán)重障礙，選育和種植抗病品種被認(rèn)為是防控枯萎病，保障相關(guān)產(chǎn)業(yè)提質(zhì)、節(jié)本、增效的重要途徑［1］。枯萎病抗性鑒評(píng)是開展枯萎病抗性育種和抗性基因定位、抗性分子標(biāo)記開發(fā)等應(yīng)用基礎(chǔ)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，研究人員主要采用田間病圃篩選鑒定和苗期人工接種枯萎病菌兩類方法進(jìn)行瓜類枯萎病抗性材料的評(píng)價(jià)和篩選，但田間病圃篩選鑒定的結(jié)果重復(fù)性差、可靠性不強(qiáng)，人工接種枯萎病菌則需耗費(fèi)相對(duì)大量的人力物力和時(shí)間成本。因此，建立一種操作簡(jiǎn)單且能快速可靠地鑒定及篩選抗感枯萎病植株的方法，對(duì)瓜類枯萎病分子育種及相關(guān)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【前人研究進(jìn)展】鐮刀菌酸別名萎蔫酸，化學(xué)名稱為5-丁基-2-吡啶甲酸，是包括有140多種專化型尖孢鐮孢菌在內(nèi)的鐮刀菌屬的許多真菌產(chǎn)生的一種非寄主特異性毒素，在尖孢鐮孢菌對(duì)動(dòng)植物致病過程中起重要作用［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)不同濃度/劑量的鐮刀菌酸對(duì)人體及哺乳動(dòng)物的心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等都有不同程度的影響或危害［4-5］。鐮刀菌酸對(duì)植物的影響也是劑量依賴型的，低濃度的鐮刀菌酸（低于10-6mol/L）能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生植物防衛(wèi)反應(yīng)，但較高濃度的鐮刀菌酸（＞10-5mol/L）則能夠破壞細(xì)胞的活性，引起細(xì)胞膜電位修飾和ATP 合成抑制、重要輔助因子螯合、電解質(zhì)滲漏以及細(xì)胞程序性死亡等［6-8］。在番茄、棉花、西瓜、黃瓜、香蕉等作物上的研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮孢菌粗毒素中的鐮刀菌酸或商業(yè)化的鐮刀菌酸純品都能誘導(dǎo)植株萎蔫和植物細(xì)胞膜損傷等枯萎病的癥狀和生理反應(yīng)，濃度越高的鐮刀菌酸引發(fā)的癥狀越嚴(yán)重，而分解脫毒鐮刀菌酸或破壞尖孢鐮孢菌合成鐮刀菌酸則能夠有效減輕致病性尖孢鐮孢菌的危害［9-13］。Kluepfel 發(fā)現(xiàn)對(duì)尖孢鐮孢菌的抗性較強(qiáng)的番茄品種對(duì)鐮刀菌酸的抗性也較強(qiáng)［14］。許勇等發(fā)現(xiàn)參試的黃瓜自然群體中，各品系對(duì)鐮刀菌酸的萎蔫指數(shù)與其對(duì)尖孢鐮孢菌的發(fā)病指數(shù)呈顯著或極顯著正相關(guān)［15］。此外，從西瓜、甜瓜、節(jié)瓜、香蕉等體細(xì)胞變異體中篩選和再生出抗鐮刀菌酸的材料，其對(duì)尖孢鐮孢菌的抗性也相應(yīng)提高［16-18］，顯示通過遺傳改良植物對(duì)鐮刀菌酸的抗性（如體細(xì)胞變異后篩選抗鐮刀菌酸的變異體）是改良植物對(duì)尖孢鐮孢菌性枯萎病的有效途徑。Wang 等研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌酸或尖孢鐮孢菌處理?xiàng)l件下，黃瓜葉片發(fā)生一系列高度相似的生理反應(yīng)，包括氣孔關(guān)閉、葉溫上升，蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、葉片含水量及水勢(shì)降低，以及葉片細(xì)胞膜損傷等。黃瓜受尖孢鐮孢菌侵染后，根部和葉片都能檢測(cè)到鐮刀菌酸，且鐮刀菌酸在葉片中積累的相對(duì)含量比根部還要高，暗示尖孢鐮孢菌入侵黃瓜維管組織后產(chǎn)生的鐮刀菌酸被運(yùn)輸?shù)饺~部，可能是造成葉片枯萎癥狀發(fā)展的關(guān)鍵因素［19］。在香蕉中也報(bào)道了相似的研究結(jié)果［20］，進(jìn)一步揭示了黃瓜等植物抗鐮刀菌酸脅迫與抗尖孢鐮孢菌侵染過程中一些重要生理反應(yīng)的相似性，顯示黃瓜等植物對(duì)鐮刀菌酸的抗性是其對(duì)尖孢鐮孢菌抗性的重要組成部分。

【本研究切入點(diǎn)】基于上述鐮刀菌酸的重要特性，利用一些對(duì)尖孢鐮孢菌和鐮刀菌酸抗/感表型一致的黃瓜、苦瓜育種研究材料作為范例，通過鐮刀菌酸處理模擬替代尖孢鐮孢菌處理，為黃瓜、苦瓜等瓜類作物枯萎病抗性鑒評(píng)提供新的便捷方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】在瓜類枯萎病抗性育種及相關(guān)應(yīng)用基礎(chǔ)研究過程中，應(yīng)用現(xiàn)行的瓜類枯萎病抗性鑒評(píng)方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等諸多問題。本研究建立一種可替代尖孢鐮孢菌進(jìn)行瓜類枯萎病抗性鑒評(píng)的高效便捷的方法，為瓜類枯萎病抗性育種及抗性基礎(chǔ)研究提供便利條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗、感尖孢鐮孢菌枯萎病的黃瓜材料3 對(duì)和苦瓜材料1 對(duì)，包括2 對(duì)業(yè)內(nèi)同行公認(rèn)的材料W2757（抗）、9930（感）和長(zhǎng)春密刺（CCMC，抗）、津研2 號(hào)（JY2H，感）；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所篩選的黃瓜材料1 對(duì)〔CsFA-Rl（抗）、CsFA-Sl（感）〕和苦瓜材料1 對(duì)〔McFA-Rl（抗）、McFA-Sl（感）〕。黃瓜F2分離群體的種子為CsFA-Rl 和CsFA-Sl 雜交后自交的后代。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)于子葉平展的植物如黃瓜，采用子葉葉盤法 挑選飽滿的黃瓜材料種子，用網(wǎng)狀種子袋包扎好，用無菌水洗滌干凈，并用55 ℃溫水浸泡15 min 后于30 ℃濕潤(rùn)條件下催芽，將萌發(fā)種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中，溫室培養(yǎng)（28 ℃、12 h 光照，25℃、12 h 黑暗，相對(duì)濕度75%～85%）；在兩葉一心期，用打孔器取出黃瓜幼苗子葉的葉盤（直徑為8 mm），置于12 孔或48 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加入適當(dāng)體積的3 mmol/L 鐮刀菌酸處理液，48 孔板用于處理單個(gè)子葉的葉盤，12 孔板可用于多個(gè)子葉盤的混合處理。

1.2.2 對(duì)于子葉不平展的植物如苦瓜，采用首片真葉法 挑選飽滿的苦瓜材料種子，用網(wǎng)狀種子袋包扎好，用無菌水洗滌干凈，用55 ℃熱水浸泡20 min，室溫浸泡4 h 后于30 ℃濕潤(rùn)條件下催芽，將萌發(fā)種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中。在苦瓜兩葉一心期取樣，選取葉面平整光滑的第一片真葉，負(fù)壓條件下進(jìn)行2 mmol/L 鐮刀菌酸處理，將處理好的葉片平整放置到濕潤(rùn)的培養(yǎng)皿中，正常光照24 h 后觀察葉片變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐮刀菌酸處理快速鑒定抗、感枯萎病的黃瓜材料

如圖1 所示，未經(jīng)鐮刀菌酸處理的黃瓜子葉葉盤均為綠色，無法區(qū)分是否為抗、感尖孢鐮孢菌枯萎病材料，但經(jīng)鐮刀菌酸處理后的黃瓜材料的子葉葉盤的顏色出現(xiàn)明顯差異，且W2757、長(zhǎng)春密刺（CCMC）和CsFA-Rl 的顏色大部分為綠色或邊緣黃化,而9930、津研2 號(hào)和CsFA-Sl 均表現(xiàn)為黃色。表1 比較了供試黃瓜材料對(duì)尖孢鐮孢菌的抗、感鑒定信息，可見對(duì)鐮刀菌酸表現(xiàn)為抗性表型的均為抗枯萎病材料，對(duì)鐮刀菌酸表現(xiàn)為敏感表型的均為感枯萎病材料。

表1 代表性抗、感枯萎病黃瓜材料對(duì)鐮刀菌酸的抗感表型鑒定Table 1 Identification of fusaric acid induced resistant/susceptible phenotype in the representative fusarium wilt resistant and susceptible cucumber

2.2 鐮刀菌酸處理快速篩選黃瓜F2 群體中抗、感枯萎病的分離單株

利用CsFA-R1 和CsFA-S1 雜交創(chuàng)制的F2分離群體，在進(jìn)行F2群體的葉盤處理時(shí)發(fā)現(xiàn)葉盤顏色整體呈現(xiàn)連續(xù)的變化，圖2 為代表性的分離單株。從F2群體中選取高抗（R++）、高感（S++）的單株，待植株長(zhǎng)至2 片真葉期，開始人工接種尖孢鐮孢菌，處理2 周后鑒評(píng)分離單株的病癥［9］。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)FA 高抗、高感表型的單株對(duì)尖孢鐮孢菌處理也分別表現(xiàn)出抗、感表型（與其父母本的抗性一致）。

2.3 鐮刀菌酸處理快速鑒定苦瓜抗、感枯萎病材料

考慮到苦瓜的子葉小而肥厚，不宜用上述子葉葉盤處理法，我們選擇用首片真葉進(jìn)行鐮刀菌酸處理。圖3 為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所鑒定保存的典型的抗、感枯萎病材料McFAR1 和McFAS1 在鐮刀菌酸處理后0、24 h 的表型。剛處理時(shí)抗感材料的葉盤顏色相近，但經(jīng)鐮刀菌酸處理24 h 后感病材料幾乎完全褪綠，而抗病材料仍然保持明顯綠色，說明利用鐮刀菌酸可以準(zhǔn)確鑒別出苦瓜抗感枯萎病材料。

3 討論

本研究采用特定濃度的鐮刀菌酸處理液對(duì)國(guó)內(nèi)黃瓜枯萎病抗性鑒定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照CCMC（長(zhǎng)春密刺，抗）和JY2H（津研2 號(hào)，感），枯萎病抗、感表型明確的黃瓜材料W2757 和9930，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育的抗感枯萎病的黃瓜材料CsFA-R1 和CsFA-S1、苦瓜材料McFAR1和McFAS1 進(jìn)行了鑒定，從播種到鑒定出抗感表型的時(shí)間為2 周左右，實(shí)際鑒定的時(shí)間在24 h 之內(nèi)，與現(xiàn)行傳統(tǒng)方法相比具有明顯優(yōu)勢(shì)。瓜類枯萎病現(xiàn)行的田間或溫室病圃法占地多、時(shí)間長(zhǎng)、工作量大，易受不同年份、不同季節(jié)氣候變化的限制和影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果受環(huán)境條件的影響而不穩(wěn)定。人工接種尖孢鐮孢菌法實(shí)驗(yàn)過程繁瑣冗長(zhǎng)、工作量大、根據(jù)早期發(fā)病指數(shù)篩選出的抗/感單株由于染菌而很難存活留種，對(duì)于接菌侵染后的病情劃分（即發(fā)病指數(shù)）易受環(huán)境和主觀因素的影響而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果似是而非，需要多次重復(fù)才能取得可信結(jié)論，另外該方法還會(huì)產(chǎn)生大量有菌的實(shí)驗(yàn)垃圾（病株和栽培用土等），需要嚴(yán)格的隔離和后續(xù)處理措施，以防病菌擴(kuò)散［21-22］。本研究利用鐮刀菌酸處理進(jìn)行鑒定和篩選，能快速準(zhǔn)確地鑒定篩選岀抗、感枯萎病的植株，且該方法無需將整棵植株用于鑒定篩選，對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育沒有任何影響，方便快捷、而且能夠節(jié)省大量人力物力成本，同時(shí)該方法不受自然氣候及病害是否發(fā)生的影響，幾乎不產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)垃圾，因而更加環(huán)保；該方法對(duì)植株的子葉或第一片真葉進(jìn)行處理，大大縮短了鑒定及篩選時(shí)間。

本研究對(duì)子葉平展的植物（如黃瓜）采用子葉葉盤處理法，對(duì)子葉不平展的植物（如苦瓜）則采用首片真葉處理法。相比較而言，首片真葉處理法的適用范圍比子葉葉盤法更廣泛，而子葉葉盤法的優(yōu)勢(shì)在于可以在植物子葉平展后即開始鑒定，更加節(jié)省時(shí)間和種植成本。本研究建立的方法可以作為初步篩選瓜類乃至其他作物抗尖孢鐮孢菌引起的枯萎病的方法，為大規(guī)模高通量鑒評(píng)作物抗枯萎病材料提供簡(jiǎn)便、高效的室內(nèi)方法。目前尚不排除某些植物材料對(duì)尖孢鐮孢菌的抗性與其對(duì)FA 抗性并不一致的情況，因此，使用本方法最保險(xiǎn)的做法是分別獨(dú)立地通過傳統(tǒng)的枯萎病菌侵染鑒評(píng)抗感表型和利用本研究建立的鑒評(píng)方法盲測(cè)，比較確定植物材料或育種材料對(duì)尖孢鐮孢菌的抗性與其對(duì)FA 抗性一致之后，后續(xù)這些材料及其衍生的分離群體的枯萎病抗性鑒評(píng)實(shí)驗(yàn)均可采用鐮刀菌酸篩選。隨著研究的深入，通過比較研究更多植物對(duì)鐮刀菌酸抗性與其對(duì)尖孢鐮孢菌抗性的生理和分子機(jī)制，將有助于該方法在更多作物枯萎病抗性育種中的推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究建立了一種利用適當(dāng)濃度的FA 處理植株子葉葉盤或首片真葉從而快速鑒評(píng)瓜類枯萎病抗性的方法，該方法可適用于瓜類乃至其他作物。與傳統(tǒng)的枯萎病抗性鑒評(píng)方法相比，本研究建立的方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)和廣泛的應(yīng)用前景，將為瓜類乃至其他作物枯萎病的抗性鑒評(píng)和抗枯萎病分子育種提供便利條件。