一株羊源A 型產氣莢膜梭菌的分離及初步鑒定

姚春陽 李通 孟衛芹 王金良

（1，山東省濱州畜牧獸醫研究院 256600；2，青島農業大學動物醫學院 266109）

產氣莢膜梭菌又稱為魏氏梭菌，其廣泛分布于自然界中，多存在于食物、飼料、糞便、土壤及人、畜腸道中[1]。產氣莢膜梭菌是引起人和動物疾病的重要病原體之一，該菌為厭氧革蘭氏陽性菌，鏡檢呈細直桿狀，兩端鈍圓，芽孢可以在114℃的高溫下存活1～4h。隨著羊養殖產業的大規模發展，各地都出現了膘情較好的青年羊產氣莢膜梭菌致死病例，該病發病急，死亡快，以腸道出血為主要癥狀，給羊養殖行業造成巨大的損失。引起羊產氣莢膜梭菌病的原因很多，當動物經歷長途運輸到達一個新的環境，或是秋、冬、初春氣候驟變而引起體質下降等應激因素都會引起疾病[2]。一般情況下，由A 型產氣莢膜梭菌引起的動物死亡是毫無征兆的，死亡速度非?？?，給診斷造成很大的困難，只有結合實驗室診斷和流行特點來做判斷[3]。本文用傳統微生物學分離和分子生物學方法對山東某羊場中患病羊病料進行細菌分離鑒定，并對分離出的細菌進行分型，旨在為該羊場產氣莢膜梭菌的治療提供實驗室檢測的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

山東省某羊場的疑似產氣莢膜梭菌感染患病羊。

1.1.2 試劑

液體硫乙醇酸鹽培養基、卵黃瓊脂培養基、綿陽血平皿為青島海博生物技術有限公司產品；革蘭氏染色液購自廣東環凱微生物科技有限公司；厭氧培養袋為日本三菱（MGC）產品；細菌DNA 提取試劑盒及Taq DNA 聚合酶預混液購自北京百泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集

采樣前使用75%酒精對羊尸體進行消毒處理，使用手術刀切開腹壁，將手術刀經火焰滅菌切開腹膜，使用無菌注射器吸取腹水并做好標記，收集完成置于冷藏并立即送往實驗室進行細菌的分離培養。

1.2.2 細菌分離

超凈臺內取腹水樣品加入滅菌1.5ml 離心管中，使用滅菌接種環蘸取樣品后分別在血平皿進行三區劃線，將平板放入厭氧培養罐中加入厭氧袋于42℃培養24h 后觀察細菌分離情況，并對分離菌進行革蘭氏染色鏡檢，對疑似菌落接種卵黃瓊脂平板42℃厭氧罐培養24h 后觀察。

1.2.3 產氣莢膜梭菌的PCR 鑒定

1.2.3.1 模版的制備

挑取單菌落接種于覆蓋有5mm 厚液體石蠟經高溫滅菌的硫乙醇酸鹽液體培養基，于42℃培養24h，取細菌培養物1.5ml，使 用DNA 提 取試劑盒提取基因組DNA存于-20℃保存備用。

1.2.3.2 產氣莢膜梭菌的PCR 鑒定引物

根據鮑長磊[6]等設計的產氣莢膜梭菌鑒定引物對分離菌進行PCR擴增。毒素預期擴增片段大小為325bp、毒素預期擴增片段大小為236bp、毒素預期擴增片段大小為584bp、毒素預期擴增片段大小為443bp，并由安徽通用生物有限公司合成。

1.2.3.3 產氣莢膜梭菌PCR 分型

PCR反應體系25μl：2XTaq Master Mix 12.5μl、無 菌ddH2O 6.5μl、上下游引物各1μl、模板4μl。PCR 反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，（毒素51℃，ε 毒素49℃，ι 毒素44℃）退火30s，72℃延伸40s，進行30 循環；72℃進行終延伸7min；4℃保存。取PCR 產物5μl 進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀拍照保存。

2 結果

2.1 細菌分離

經42℃培養24h 后在綿羊血平板上形成淡灰色、圓形、光滑、隆起的有雙層溶血環菌落，其內環透明、完全溶血，外環淡綠、不完全溶血（圖1）。革蘭氏染色為革蘭氏陽性兩端鈍圓的大桿菌（圖2）。挑取單菌落在卵黃瓊脂板上形成圓形、灰白色、表面光滑濕潤、微凸、邊緣整齊的菌落，在菌落周圍培養基中形成明顯的不溶性、不透明、白色的沉淀（圖3）。

圖2 產氣莢膜梭菌革蘭氏染色

圖3 產氣莢膜梭菌卵黃瓊脂培養

2.2 產氣莢膜梭菌的分型PCR 鑒定

PCR 鑒定結果顯示，在325bp 位置出現目的條帶（圖4）其他無目的條帶，證明為A 型產氣莢膜梭菌。

圖4 A 型產氣莢膜梭菌毒素基因PCR

3 討論

產氣莢膜梭菌可引起多種人獸共患傳染病，臨床癥狀不明顯，易引起死亡，已成為危害人類及養殖業的重要疾病之一。產氣莢膜梭菌是感染牛、綿羊最常見的病原微生物之一，該菌產生的毒素數目多，致病力強。傳統分型方法根據所產生的毒素、毒素、毒素、毒素將其分為5 個毒素型，即A 型(產毒素)、B 型(產毒素)、C 型（產毒素）、D 型(產毒素)、E 型(產毒素)[4]。產氣莢膜梭菌所分泌的外毒素是其主要致病因子[5]，多作用于腸道，造成感染動物的急性死亡，其中A 型產氣莢膜梭菌易引起氣性壞疽和食物中毒[6]。

治療羊產氣莢膜梭菌的理論上使用抗生素進行抗菌治療，但很多患病羊常沒有任何臨床癥狀，突然倒地死亡，或處于急性期的患病羊來不及治療，在較短時間內死亡。因此，防治此病，預防免疫變得十分重要。產氣莢膜梭菌病明顯的癥狀是患病動物死亡后腹部膨脹，這是由于細菌產氣所導致。預防該病主要是加強平時的飼養管理，注意氣溫突變對動物帶來的影響，發現病羊要立即轉移至地勢高、干燥的草地上進行放牧，如果條件允許可采取轉場[7,8]。為了有效預防羊梭菌病的發生，在做好羊三聯四防疫苗免疫的同時，可適當加強羊群中藥保健，羊場環境消毒等綜合防控措施。