干旱脅迫下發菜光合作用相關基因差異表達分析

馬曉蓉，梁新華，張 箏，胡進紅，周思麗，梁文裕

(寧夏大學 生命科學學院, 銀川 750021)

發菜(Nostocflagelliforme)是一種分布在中國西北干旱半干旱荒漠草原地區的陸生固氮念珠藻。發菜為適應干旱的生存環境，進化出一系列獨特的形態結構和生理代謝特性來適應干旱，如細胞被主要成分為多糖的膠質鞘包裹，使發菜具有極強的吸收水分和保持水分的能力，在極端干旱環境下與其他旱生植物相比具有更強的適應能力，干旱脅迫下發菜生理活性降低甚至進入類似休眠狀態以度過不良時期[1]。已有研究表明，陸生念珠藻耐干旱的機理是其結構、生理及分子水平上協調作用的綜合反映[2]。

由于光合作用作為發菜生長發育的生理基礎和能量代謝的起點，其相關基因差異表達及其調控的機制對深入理解其生長發育和抗逆機制至關重要，雖然目前對發菜響應干旱脅迫的光合生理及蛋白質表達規律有了初步的認識，然而發菜在干旱脅迫條件下光合機構及光合作用相關基因如何變化以適應干旱脅迫并不明確。因此，本研究采用高通量測序技術及生物信息學方法對發菜干旱脅迫下差異表達的光合作用相關基因進行篩選，采用qRT-PCR進一步分析關鍵基因差異表達規律，并對光合色素和相關酶活性進行檢測，進而解析干旱條件下發菜光合相關基因差異表達規律，為深入認識發菜耐旱的光合分子機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

將采自寧夏賀蘭山自然生長的發菜培植于培養床上，持續培養10 d，測定光合速率及Rubisco活性，與野生狀態發菜進行比較，確保發菜處于正常生長狀態后對樣品進行處理。發菜失水率0%的樣品為對照組(A)，經過失水處理30 min、60 min和48 h分別獲得發菜失水率為30%的樣品(B)、75%的樣品(C)和100%的樣品(D)。每組處理重復3次。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA測序文庫構建發菜RNA提取采用楊佳[9]的方法。樣品總RNA質量檢測合格后，構建測序文庫。將RNA樣本充分混合，然后去除rRNA富集mRNA。以mRNA為模板，合成第一條cDNA鏈，經過dNTP反轉錄合成第二條cDNA鏈，純化雙鏈cDNA以及做末端修復、加polyA并連接測序接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增，建立樣本轉錄組測序文庫。

使用核酸蛋白定量儀(Qubit2.0)初步定量構建完成的文庫，稀釋文庫至1 ng/μL，隨后使用安捷倫2100生物分析儀(Agilent 2100)對文庫的大小進行檢測。采用qRT-PCR方法將插入片段符合預期的文庫準確定量其有效濃度(文庫有效濃度>2 nmol/L)，以確保文庫質量達到送樣要求。

1.2.2 Illumina HiSeq測序及差異基因篩選通過高通量Illumina HiSeq PE150測序平臺對已構建好的文庫進行測序獲得原始數據。對原始數據進行去除帶接頭(adapter)的讀段(reads)、去除N(N表示無法確定堿基信息)的比例大于10%的reads和去除低質量reads(堿基質量值Phredscore≤5的堿基數占整個讀段長度的50%以上)的處理，獲得測序后的過濾數據(clean reads)。然后以發菜基因組(http://genome. kazusa.or.jp/cyanobase/NostocflagelliformeCCNUN1)作為參考基因組進行序列比對。以P<0.05為光合作用相關差異表達基因篩選標準。

1.2.3 光合作用相關基因的qRT-PCR分析選擇轉錄組測序中篩選的部分重要差異光合作用相關基因進行qRT-PCR驗證。qRT-PCR定量實驗用(Vazyme)諾唯贊生物科技有限公司(中國，南京)試劑盒完成。熒光定量檢測用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒。根據NCBI上已發表的發菜基因組信息，用Primer Premier 5.0設計目的基因擴增引物(表1)，內參基因16S rDNA引物16S-F和16S-R，用Roche LightCycler480型熒光定量PCR儀進行反應，PCR擴增條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 1 min；共41個循環。采用2-ΔΔCt方法[10-11]分析基因的相對表達量，每個反應3次重復。

表1 基因功能注釋及引物序列

1.2.4 光合色素含量檢測藻藍素、異藻藍素、藻紅素和藻膽素含量測定參照張薇君等[12]的方法。

藻藍素(PC，mg·mL-1)=0.187OD620-0.089OD652

異藻藍素(APC，mg·mL-1) = 0.196OD652-0.041OD620

藻紅素(PE，mg·mL-1) =0.104OD562-0.253PC-0.088APC

藻膽蛋白(w，%)=PC%+APC%+PE%

葉綠素a、類胡蘿卜素含量測定參照馬增嶺[13]的方法。

葉綠素a含量：Ca (μg·mL-1)=16.29×OD665-8.54×OD652

類胡蘿卜素含量：C (μg·mL-1)=7.6×(OD480-1.49×OD510)。

1.2.5 干旱脅迫下Rubisco和GAPDH活性測定采用蘇州科銘生物技術有限公司對Rubisco活性進行測定。在340 nm吸光度的變化可計算還原型輔酶Ⅰ氧化速率，還原型輔酶Ⅰ氧化速率可反映Rubisco的活性。25 ℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH，按樣本蛋白濃度計算Rubisco活性。

GAPDH活性測定采用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒。通過分光光度計測定340 nm處NADPH減少量計算GAPDH活性，每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

1.3 數據處理

所得實驗數據用SPSS Statistics 26.0、Origin和Excel進行方差分析檢驗結果的差異顯著性并作圖。

2 結果與分析

2.1 測序數據質量評價

樣本測序數據中，每個樣本的錯誤率≤0.03%，測序堿基質量值大于20的堿基占總體堿基的百分比在97%以上、大于30的堿基在93%以上。GC含量占總堿基的45%左右。測序數據具有較高的準確性。對發菜4個的不同樣本進行相關性檢測，樣本間的相關系數均大于0.88，表明測序數據可靠、樣本間重復性良好且變異不大。

2.2 干旱脅迫下發菜光合作用相關基因的差異表達

對發菜干旱脅迫下所有差異表達基因通過KEGG pathway顯著性富集進行分析，選擇顯著富集到光合作用途徑的相關基因(P<0.05)，包含113個差異基因(表2)。以失水率0%(A)為對照，失水率30%(B)發菜光合作用的差異基因共有44個，失水率75%(C)發菜光合作用的差異表達基因共有74個，失水率100%(D)發菜光合作用差異表達基因共有91個。B、C和D均有顯著差異基因的個數為31個(圖1)。進一步分析表明，B樣上調基因為8個，占光合作用總差異基因18.2%，下調基因為36個，占光合作用總差異基因81.2%；C樣上調基因為21個，占光合作用總差異基因28.4%，下調基因為53個，占光合作用總差異基因71.6%；D樣上調基因為46個，占光合作用總差異基因50.5%，下調基因為45個，占光合作用總差異基因49.5%。

表2 不同發菜樣品參與光合作用相關的差異表達基因

續表2 Continued Table 2

續表2 Continued Table 2

2.3 干旱脅迫下發菜光合作用相關差異基因的qRT-PCR分析

對干旱脅迫下發菜12個光合相關基因進行qRT-PCR分析。結果表明，隨著干旱脅迫程度的加深，Psb27、gap2、PsbL、PetE、PsbX、ZDS和PetJ先下降然后上升最后又下降，且都在失水率為75%時表達量最高。PsaK、CrtW、CRTISO5、PetH和PsaB呈現出先上升后下降的趨勢，且PsaK、CrtW、CRTISO5基因在失水率為75%時表達量最高，而PetH和PsaB基因在失水率為30%時表達量最高。實時熒光定量反應的結果與RNA-seq數據基本一致，從而證實了發菜干旱脅迫下這些基因的表達模式(圖2)。

A. 失水率為0%的樣品；B. 失水率為30%的樣品；C. 失水率為75%的樣品；D. 失水率為100%的樣品；vs. 比較；下同圖1 干旱脅迫下發菜光合作用相關差異表達基因A. Water loss 0%; B. Water loss 30%; C. Water loss 75%; D. Water loss 100%; vs. Control; the same as belowFig.1 Differential expression genes related to photosynthesis of N. flagelliforme under drought stress

圖2 不同干旱脅迫下發菜光合相關基因的qRT-PCR分析Fig.2 Analysis of qRT-PCR data of photosynthesis-related genes from N. flagelliforme under drought stress

2.4 干旱脅迫下發菜光合色素含量及相關酶活性分析

發菜藻藍素、異藻藍素、藻紅素和藻膽素隨著干旱脅迫的加強，其含量呈顯著降低的趨勢。藻藍素、異藻藍素、藻紅素和藻膽素含量在失水率為0%時與30%、75%和100%時呈現顯著差異，但在失水率為30%、75%和100%時，相互之間沒有顯著性差異(圖3)。

PC.藻藍素；APC.異藻藍素；PE.藻紅素圖3 干旱脅迫下發菜色素含量和酶活性檢測PC. Phycocyanin; APC. Allophycocyanin; PE. PhycoerythrinFig.3 Detection of pigment contents and enzyme activities of N. flagelliforme under drought stress

發菜葉綠素a和類胡蘿卜素含量隨干旱脅迫的增加呈顯著下降趨勢。失水率為0%時與30%、75%和100%時葉綠素a和類胡蘿卜素含量呈現顯著差異，但類胡蘿卜素含量分別在失水率為0%和30%時及30%和75%時沒有顯著性差異(圖3)。

Rubisco活性隨著干旱脅迫的增加呈現先上升后下降的趨勢(圖3)，且失水率為30%的時候Rubisco活性達到最大值，但在失水率為0%、75%和100%時相互之間沒有顯著性差異。隨著干旱脅迫的增加，GAPDH的活性逐漸下降，失水率為0%時與30%、75%和100%時GAPDH的活性差異顯著，但在失水率為75%和100%時沒有顯著性差異(圖3)。

3 討 論

3.1 干旱脅迫對發菜光合色素及相關基因差異表達的影響

光合色素包括葉綠素、反應中心色素和輔助色素等，存在于類囊體膜上，主要參與光能吸收、傳遞，以及原初光化學反應等過程。與高等植物相比，藍藻有其特殊的光捕獲系統，主要由藻膽體(PBSs)組成，而藻膽體由藻膽蛋白和接頭多肽組成。藻膽體主要分為藻藍素(PC)、異藻藍素(APC)和藻紅素(PE)。PE吸收的光能先遷移到PC，然后轉移到APC，最后轉移到葉綠素a[14]。本研究發現12個參與光合作用的捕光色素復合體基因顯著下調表達，而且隨著干旱脅迫的持續增加，發菜藻藍素、藻紅素和異藻藍素含量有所下降，即藻膽素含量總體下降，同時葉綠素a的含量明顯降低。因此，推測干旱脅迫致使大部分發菜光合作用捕光色素復合體基因下調表達，光合色素蛋白減少，捕獲光能的能力減弱，光合作用受到抑制，從而降低發菜在干旱脅迫條件下光合系統遭受破壞的風險，這也是發菜適應干旱脅迫的一種光保護調節機制。

類胡蘿卜素具有捕獲光能并將其傳遞給葉綠素的功能[15]。由于干旱脅迫會導致水稻葉片中水分缺失，細胞膜被破壞或消失，類囊體膜出現解體，使得葉綠素和類胡蘿卜素含量降低，進而影響光合作用的進行[16]，而本研究發現發菜葉綠素a和類胡蘿卜素含量隨干旱脅迫的增加呈顯著下降趨勢，暗示干旱脅迫會使發菜葉綠素a和類胡蘿卜素合成相關蛋白(酶)的基因差異表達，進而導致其含量下降而影響光合作用。目前已經確認，ZDS、crtW和CRTISO基因參與類胡蘿卜素生物合成和分解代謝途徑。ZDS是類胡蘿卜素生物合成途徑上游控制β-胡蘿卜素生成的關鍵酶，它催化9,9-雙順-β-胡蘿卜素脫氫生成7,9,7,9-四順式-番茄紅素[17]，該酶的活性和表達量的多少直接決定了β-胡蘿卜素的產量，是調控β-胡蘿卜素合成量的關鍵酶。crtW基因編碼crtW型β-胡蘿卜素酮醇酶，β-類胡蘿卜素經β-胡蘿卜素酮醇酶催化形成角黃素[18]。CRTISO是催化番茄紅素由順式結構轉變為反式結構的關鍵異構酶[19]，CRTISO的下調表達使果實中β-胡蘿卜素的含量提高[20]，而且CRTISO表達量的降低抑制了類胡蘿卜素降解反應的進行，還可能會導致煙草中類胡蘿卜素的積累[21]。在本研究中，隨著干旱脅迫的增加，ZDS基因顯著下調，crtW和CRTISO5基因顯著上調，說明這些基因抑制了干旱脅迫下發菜類胡蘿卜素的增加，導致類胡蘿卜素捕獲光能并將其傳遞給葉綠素的功能減弱，進而影響光合速率。

3.2 干旱脅迫對發菜光反應與卡爾文循環相關基因差異表達的影響

PsaK和PsaB是光系統I中重要的核心蛋白，且在PSⅠ捕光復合物中起重要作用[22-23]。JIA等[24]發現在鹽堿脅迫下，海棠中PsaK等6種與光合作用相關的蛋白顯著上調，且這些蛋白可以作為PS Ⅰ修復系統的調節劑。而在鎘脅迫下，由于煙草中PsaK和PsaB顯著下調而使PSⅠ系統受到嚴重的光抑制作用[25]。PetE和PetJ是光合作用中電子傳遞鏈重要的組成成分，有助于提高光反應的電子傳遞效率[26]。有研究發現雖然PetE基因失活沒有影響藻細胞的生長速率，但影響了光合電子傳遞鏈的氧化還原狀態[27]。Psb27蛋白是PSⅡ重要的組裝修復因子之一，它位于PSⅡ核心復合體的囊腔側，可使Mn與PSⅡ放氧復合體OEC更容易結合[28]。在低溫、高光或干旱等脅迫條件下，對維持PSⅡ的高效組裝修復起著重要作用。本研究發現，干旱脅迫下發菜PsaK、PsaB、PetE、PetJ和Psb27均呈上調表達，表明干旱脅迫誘導了這些基因的表達，有利于穩定PSⅡ和PSI的結構以免受到干旱脅迫的破壞，且修復受損的PSⅠ和PSⅡ，穩定光合電子傳遞鏈的氧化還原狀態，為發菜恢復吸水后快速進入光合作用奠定了結構基礎。PsbL參與了PSⅡ中電子轉移的調節，在PSⅡ電子轉移過程中具有重要作用[29]。另外，PetH是光合電子傳遞鏈上的催化酶，可以將電子從PSⅠ傳遞到NADP+，產生的NADP會參與到CO2的同化，PetH酶活性的降低會影響CO2的同化過程，進而影響植物的光合反應[30]。有研究發現高濃度鋅脅迫下，PetH基因顯著上調，從而維持了正常的電子傳遞效率[31]。但本研究發現隨著干旱脅迫的增加，PsbL和PetH卻顯著下調表達。由于發菜在持續失水狀態下水分的虧缺會導致光合活性下降[32]，推測PetH和PsbL基因顯著下調抑制了光合電子傳遞鏈的活性，導致光合活性維持在較低水平甚至光合作用停止，這與QIU等[33]的結論一致。

干旱脅迫除了對發菜光反應過程有影響外，對其暗反應過程也產生了影響。Rubisco作為卡爾文循環的關鍵酶之一，可催化卡爾文循環中RUBP與CO2形成兩分子3-磷酸甘油酸(3-PG)[34]。在3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的催化下三磷酸甘油酸被還原為了三磷酸甘油醛，它不僅是合成核酮糖-5-磷酸的底物，也是光合產物輸出的一種途徑，GAPDH活性水平與卡爾文循環的運轉速率有關[35]。有研究表明，逆境脅迫引起的Rubisco活性下降，并降低核酮糖-1,5-二磷酸和3-磷酸甘油的含量，從而抑制無機磷的再生，進而影響光合作用[36]。此外，Sen等[37]發現隨著干旱脅迫的增加，魚腥藻PCC 7120的Rubisco酶活性下降，從而導致光合活性降低。本研究表明，隨著干旱脅迫的增加，GAPDH的活性呈現下降的趨勢，Rubisco活性升高后下降，表明隨著干旱脅迫的增加，這兩種酶活性的下降可能導致光合碳同化效率的降低，進而影響發菜的光合活性。

綜上所述，干旱脅迫下發菜有113個光合作用相關基因發生了差異表達，干旱脅迫誘導部分光合相關基因上調表達，而另一些基因下調表達，共同調控發菜響應干旱脅迫，這可能是發菜應對干旱不利環境的一種光保護和光適應機制。研究結果為深入認識發菜耐旱的光合機理奠定了基礎，為后續發菜抗性基因的挖掘、篩選以及研究發菜干旱脅迫響應機制提供了重要的參考價值。