RhoGDI1通過(guò)抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)其順鉑耐藥性的研究*

謝明忠，尹 靜，林碧蓉，李 茜，古欽文，戚力升，彭道琥，朱 凱，李 森△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，四川瀘州 646699；2.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院麻醉科 400700)

骨肉瘤(osteosarcoma)是兒童和青少年最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤，多見(jiàn)于長(zhǎng)骨干骺端，細(xì)胞異質(zhì)性高，極易出現(xiàn)耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者死亡[1]。從某種程度上來(lái)說(shuō)，近30年來(lái)骨肉瘤患者5年存活率未能進(jìn)一步提高的主要原因是化療耐藥。近期1項(xiàng)多中心、大樣本的臨床研究顯示經(jīng)典的MAP(methotrexate甲氨蝶呤，cisplatin順鉑，doxorubicin阿霉素)化療方案仍是治療骨肉瘤的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。此外，雖然順鉑作為1種DNA損傷藥物，屬于臨床治療骨肉瘤的經(jīng)典化療方案用藥，但其劑量相關(guān)的腎毒性、耳毒性、性功能障礙等并發(fā)癥，限制了其臨床使用劑量[3-4]。Rho蛋白鳥(niǎo)苷酸解離抑制因子-1(RhoGDI1) 是非常重要的調(diào)控Rho蛋白活性的信號(hào)分子，其發(fā)揮生理功能是通過(guò)與Rho蛋白結(jié)合形成復(fù)合物[5]。既往研究發(fā)現(xiàn)RhoGDI1在多種惡性腫瘤中表達(dá)水平上調(diào)，如在高侵襲性的卵巢癌、肺癌、結(jié)直腸癌中，RhoGDI1和RhoGDI1-Rac1復(fù)合物的水平均顯著升高[6]。同時(shí)，RhoGDI1在腫瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)及患者的預(yù)后密切相關(guān)[7]。靶向RhoGDI1的siRNA能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)能增加對(duì)化療藥物紫杉醇的敏感性[8-9]。綜上所述，隨著對(duì)RhoGDI1研究的深入及相關(guān)信號(hào)通路的闡明，RhoGDI1已成為一個(gè)新的抗腫瘤治療靶點(diǎn)[10-12]，但目前尚無(wú)抑制RhoGDI1的表達(dá)可以抑制骨肉瘤順鉑耐藥性的研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

人骨肉瘤細(xì)胞系143B[13](武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，順鉑(中國(guó)Selleck公司)，青鏈霉素雙抗、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.05% 胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，PCR引物(深圳華大基因)，LipofectamineRNAiMAX和TRIzol(美國(guó)Invitrogen 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，CCK-8 試劑盒(日本同仁公司)，熒光素酶檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche公司)、Transwell小室(美國(guó)Corning公司)。

1.2 CCK-8法篩選藥物濃度

143B細(xì)胞用胰酶消化后，重懸于新鮮的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，按照4 000～5 000/孔細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，每孔加入不同濃度的順鉑，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，濃度梯度分別為0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μmol/L和10.0 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液 (0.5 mg/mL) 繼續(xù)孵育2～4 h，用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm處的吸光度(A)值，半數(shù)抑制濃度(IC50)通過(guò)軟件進(jìn)行非線(xiàn)性擬合求得。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照A值)/空白對(duì)照A值；抑制率=1-存活率。

1.3 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染前1天將143B細(xì)胞按5×104/孔接種于24孔板中，轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將5 μL LipofectamineRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑分別與50 nmol/L siRNA-RhoGDI1-1(si-RhoGDI1-1組)、siRNA-RhoGDI1-2(si-RhoGDI1-2組)和siRNA-control(si-Control組)混合，并將只有轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照組(Blank組)，室溫靜置5 min后，棄去24孔板中原培養(yǎng)液，加入上述混合液，于 37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng) 6 h后，換為正常培養(yǎng)液，此時(shí)記為0 h，分別在第48和72 h后用TRIzol法提取總RNA。轉(zhuǎn)染前1 d，143B細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板(紅色區(qū)域)，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按上述濃度轉(zhuǎn)染siRNA-RhoGDI1和siRNA-control，于 37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng) 6 h后，換為正常培養(yǎng)基，此時(shí)記為0 h。分別在24、48和72 h后用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

棄去24孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加入200 μL TRIzol充分裂解細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，加入40 μL 三氯甲烷，劇烈振蕩混勻，室溫靜置5 min后12 000×g離心15 min。用粗口槍頭吸取第1層上清液至新的離心管中，加入等體積異丙醇，并輕柔顛倒充分混勻，室溫靜置10 min后12 000×g離心10 min，并用70%乙醇漂洗2次。室溫晾干后加入 20～50 μL無(wú) RNase水溶解并測(cè)定RNA 濃度。然后按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行一鏈cDNA合成和RT-qPCR。BAX-正向:5′-CAC CAG CTCT GAG CAG ATC ATG AAG-3′;BAX-反向:5′-GCG GCA ATC ATCC TCT GCA G-3′ 。引物為：RhoGDI1-正向5′-GGA TGA GCA CTC GGT CAA CTA-3′；RhoGDI1-反向5′-GCC TCC TTG TAC TTT CGC AG-3′ 。RT-qPCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 10 s，60 ℃，72 ℃ 20 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；添加熔解曲線(xiàn)。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

消化143B細(xì)胞并用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)算細(xì)胞密度，調(diào)整濃度為1×105/mL，在上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加600 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)基，每組細(xì)胞都設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出小室并棄掉上室的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用干棉簽吸走上室液體，用濕棉簽輕輕拭去上室細(xì)胞，結(jié)晶紫染液染色30 min，再次用PBS漂洗2次。計(jì)數(shù)基底膜下室的細(xì)胞數(shù)，倒置顯微鏡200倍光鏡下選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿過(guò)小室的骨肉瘤細(xì)胞數(shù)并計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞的平均細(xì)胞數(shù)，其細(xì)胞數(shù)量代表骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的大小。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

各組143B細(xì)胞接種于24孔板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至70%～80%密度后，用10 μL槍頭劃出1條劃痕，更換新鮮培養(yǎng)基除去漂浮細(xì)胞后，顯微鏡下拍照并作為0 h對(duì)照，并于48 h后再觀察拍照劃痕并計(jì)算劃痕愈合情況。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

各組143B細(xì)胞用胰酶消化后，重懸于新鮮的含10% FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，按照 3×105/孔接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后，每孔加入不同濃度的藥物，濃度梯度分別為0 μmol/L、 0.625 μmol/L、1.250 μmol/L、2.500 μmol/L，培養(yǎng)2 d，棄培養(yǎng)基，每孔加 1 mL 0.25%的胰酶進(jìn)行消化，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，1 200×g離心3 min，棄上清液，PBS緩沖液清洗2次。加入碘化丙啶(PI) 1 mL (5 mg/mL)，室溫避光20 min。上機(jī)檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 利用siRNA敲低RhoGDI1

本研究設(shè)計(jì)了RhoGDI1的兩條干擾序列，將其導(dǎo)入骨肉瘤細(xì)胞系143B細(xì)胞后，48 h和72 h后分別收集RNA，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)si-RhoGDI1-1組、si-RhoGDI1-2組RhoGDI1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較si-Control組明顯降低(P<0.01),見(jiàn)圖1。

2.2 敲低RhoGDI1降低了143B細(xì)胞的增殖

CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)si-RhoGDI1-1組、si-RhoGDI1-2 2組骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力較si-Control組明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.3 敲低RhoGDI1降低了143B細(xì)胞侵襲和遷移能力

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與si-Control組比較，si-RhoGDI1-1組、si-RhoGDI1-2組遷移到下室的143B細(xì)胞數(shù)顯著減少，見(jiàn)圖3A。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與si-Control組比較，si-RhoGDI1-1組、si-RhoGDI1-2組的143B細(xì)胞修復(fù)能力減弱(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖3B。

a:P<0.05與si-Control組比較。

a:P<0.05與si-Control組比較。

A：Transwell實(shí)驗(yàn)；B：劃痕實(shí)驗(yàn)定量分析;a P<0.05;b P<0.01,與si-Control組比較。

2.4 干擾RhoGDI1表達(dá)可以降低了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性

CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與si-Control組比較，si-RhoGDI1-1組、si-RhoGDI1-2組143B細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受性明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5 RhoGDI1通過(guò)凋亡影響骨肉瘤細(xì)胞順鉑耐受性

FACS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)si-RhoGDI1-1組的凋亡標(biāo)記物AnnexinV陽(yáng)性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)較si-Control組增加(P<0.01)，見(jiàn)圖5A、B；而RT-qPCR分析顯si-RhoGDI1-1組、si-RhoGDI1-2組的凋亡誘導(dǎo)因子Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)水平較si-Control組升高(P<0.01)，見(jiàn)圖5C。

a:P<0.05與si-Control組比較。

A.FACS;B.AnnexinV陽(yáng)性細(xì)胞百分比；C.RT-qPCR定量分析；a:P<0.01。

3 討 論

RhoGTPase屬于Rho家族小分子G蛋白，該家族包括Rho、Rac和Cdc42亞家族，在形態(tài)變化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞質(zhì)分裂等細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要作用[14]。同許多Rho家族成員一樣，RhoGTPase可以在有活性的GTP結(jié)合形式和無(wú)活性的GDP結(jié)合形式間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，可通過(guò)調(diào)節(jié)下游酶聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮分子調(diào)控開(kāi)關(guān)的功能[15]。有兩種類(lèi)型的調(diào)節(jié)因子調(diào)控了RhoGTPase的激活和失活：GDP/GTP交換蛋白發(fā)揮激活作用，而鳥(niǎo)苷酸解離抑制因子(GDP dissociation inhibitor,GDI)通過(guò)直接結(jié)合到RhoGTPase上抑制其活性，在細(xì)胞質(zhì)中RhoGTPase優(yōu)先與GDP結(jié)合形成復(fù)合物RhoGTPase，抑制RhoGTPase轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié)合形式，從而使處于細(xì)胞質(zhì)的RhoGTPase酶保持非活性狀態(tài)；細(xì)胞膜上RhoGTPase與GTP結(jié)合形式的RhoGTP酶相結(jié)合，阻遏GTP酶的水解，維持RhoGTPase酶的活性狀態(tài)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤細(xì)胞系143B中干擾RhoGDI1表達(dá)，143B細(xì)胞的增殖和遷移速度顯著下降，其對(duì)順鉑的耐受性明顯下降。與si-Control組細(xì)胞比較，干擾RhoGDI1表達(dá)的143B細(xì)胞的凋亡比例明顯增加，促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)也升高。Bax是Bcl-2家族的促凋亡因子，其在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)[17]。本研究結(jié)果提示RhoGDI1具有抑制細(xì)胞凋亡的功能。

綜上所述，RhoGDI1與骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及快速增殖密切相關(guān)，可能是一個(gè)有效的骨肉瘤預(yù)后標(biāo)志物，同時(shí)，其表達(dá)降低可以提高骨肉瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。有關(guān)RhoGDI1在骨肉瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及耐藥性中的作用機(jī)制將是筆者下一步的研究重點(diǎn)。本研究也為臨床中通過(guò)調(diào)節(jié)RhoGDI1的表達(dá)水平提高骨肉瘤化療敏感性提供了理論參考。