SD大鼠視網膜神經節細胞體外分離培養及高糖模型建立

楊 曼，譚 薇，劉 暢

0引言

視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)是視網膜的唯一輸出神經元，對于視覺功能和晝夜節律至關重要[1]。RGCs及其視神經軸突神經退行性改變是引起嚴重視覺損害的多種疾病的基礎，探索RGCs的病理改變和簡單高效的RGCs體外原代培養模型的建立尤為重要。

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)可導致嚴重的視力喪失。有研究已經證實，在DR發展早期，沒出現視網膜微血管病變之前就已經出現糖尿病性視神經病變[2-3]。因此，探索DR早期視網膜神經元的變化對DR的病理發生發展過程有著重要意義。與糖尿病動物模型實驗相比，在體外建立原代RGCs高糖模型，不僅可以排除機體可能存在的其他干擾因素，還可以更直觀地觀察高糖誘導特定階段的RGCs的變化。RGCs為高度分化細胞，不會增殖，所以只能進行原代培養，使得RGCs體外培養難度加大。目前針對RGCs細胞培養方法以及高糖處理的細胞模型建立仍十分有限，本文旨在通過體外實驗探索出更為簡單有效的RGCs細胞培養方法以及高糖處理的細胞模型建立，為研究DR導致的RGCs病變體外細胞建模提供一定基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物實驗中使用的所有新生(1～3d)SD大鼠均由遵義醫科大學實驗動物中心提供，實驗SD大鼠飼養濕度：50%～65%，溫度：20℃～25℃，環境安靜，避免強光照射,通風換氣：每小時8～12次，雌雄不限，符合國家醫用動物使用標準，SPF級，遵守《ARVO眼科和視覺研究中動物的使用聲明》并通過《遵義市第一人民醫院動物倫理審查》。

1.1.2主要試劑磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、L-谷氨酰胺、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)均購于美國Sigma公司；B-27 Serum-Free Supplement(美國Invitrogen公司)；Neurobasal Medium、0.25%胰蛋白酶均購于美國Gibco公司；100×青霉素/鏈霉素、甲苯胺藍染液購于北京索萊寶公司；胸腺細胞抗原-1(Thymus cell antigen-1，Thy-l)抗體、Mouse Anti Brn-3a monocloal Antibody(Brn-3a)、CD11b抗體、熒光二抗[熒光(Cy3)標記羊抗小鼠IgG]均購于英國Abcam公司；多聚賴氨酸-D(大連美侖生物技術有限公司)；75%乙醇(南京醫用試劑)；濃縮型正常山羊血清(封閉)(武漢博士德生物工程有限公司)；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色FITC標記檢測法)(南京凱基生物科技發展有限公司)；CCK8試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)；抗熒光淬滅封片劑(美國SouthernBiotech公司)；0.3% Triton X-100(上海碧云天公司)。主要試劑配制見表1。

表1 主要試劑配制

1.2方法

1.2.1器械準備將實驗操作所需的顯微手術器械進行高壓滅菌消毒；細胞培養間、光學顯微鏡、耗材、超凈工作臺等提前并不低于30min紫外燈照射滅菌。

1.2.2培養板/培養瓶及爬片的包被用CD11b溶液、Thy-1抗體(稀釋比為1∶500)及0.01%多聚賴氨酸-D室溫下包被培養瓶或預先放好無菌爬片的培養板，放入37℃恒溫箱2h(或者放入37℃恒溫箱包被過夜，包被好的培養板可放于4℃冰箱，用PBS洗3次，每次5min，超凈工作臺晾干備用。

1.2.3RGCs的分離和接種及純化培養(1)細胞分離：取出生后1～3d的SD大鼠，用75%乙醇浸泡消毒15～20min后在顯微鏡下無菌取眼球，并將眼球放于加入適量100×青霉素/鏈霉素的PBS液玻璃培養皿中，浸泡15min后，在解剖顯微鏡下用眼科顯微剪沿角膜緣后0.5mm剪開眼球，用眼科顯微鑷去除新生鼠晶狀體和玻璃體，剝離視網膜神經層組織并用顯微剪剪碎，加入適量0.25%胰蛋白酶(10只眼球約需3mL)放入37℃，5%CO2恒溫箱消化15～20min(每隔3～5min拿出來用玻璃吸管輕輕吹打懸液5～8次)，待大鼠視網膜組織完全消化后，1 500r/min離心5min，去除上清液。加入與胰蛋白酶等量的Neurobasal Medium溶液震蕩1～2次，終止消化，1 500r/min離心5min去除上清液。(2)細胞純化：終止消化離心去上清液后加入2mL配制好的CD11b溶液，輕輕振蕩3～5min，使膠質細胞等充分與抗體結合，1 500r/min離心5min去除上清液。加入適量Neurobasal Medium，40μm濾網過濾細胞到預先用山羊抗大鼠IgG抗體包被過的培養瓶中，37℃，5%CO2恒溫孵育20～25min，使細胞懸液中結合了CD11b抗體的細胞通過抗原抗體反應沉積在培養瓶底部。再將細胞懸液倒入預先用Thy-1抗體(稀釋比為1∶500)包被過的培養瓶，37℃，5%CO2恒溫孵育30min，讓RGCs充分與抗體結合，吸出上清液，PBS漂洗培養瓶3～5次，適量0.25%胰蛋白消化5～10min，等量的Neurobasal Medium溶液震蕩1～2次，終止消化，1 500r/min離心5min去除上清液，完成細胞純化。(3)細胞接種：細胞純化后加入適量的配置的培養基，使用細胞濾網(70μm)均勻的接種于培養板中，在加入適量培養液，調整細胞數為1×105cell/mL，并對培養板做好標記后放入5%CO2細胞孵育箱(37℃)中孵育。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況(細胞大小、形狀、軸突長短等)并拍照，3d左右對其進行培養基全量換液。

1.2.4甲苯胺藍染色鑒定視網膜神經元提取3～5d在體外純化培養的細胞，將已長有細胞的爬片用PBS浸洗3次，每次5min；加入適量4%多聚甲醛剛好浸沒爬片，固定30min后用PBS浸洗3次，每次5min；加入尼式染色試劑后將爬片置于50℃～60℃干燥箱浸染30～40min，PBS浸洗爬片3次，每次5min，95%乙醇分化脫水3～5s，PBS浸洗爬片3次，每次5min，顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5體外純化培養細胞的鑒定細胞在體外培養3～5d后，在培養板中將已長有細胞的爬片用PBS浸洗3次，每次5min；用4%多聚甲醛固定爬片30min，PBS浸洗爬片3次，每次5min。固定完成后的爬片用配制好的Triton X-100對細胞進行通透20min(室溫)后用PBS浸洗爬片3次，每次5min。細胞完成通透后，室溫下在玻片上滴加足量的封閉液(山羊血清)對爬片進行封閉30min；吸水紙吸干每張爬片上的山羊血清后在滴加足已浸沒爬片的一抗(稀釋比為1∶50)放入濕盒，4℃孵育過夜。第2d加熒光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次5min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min(注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行)；適量DAPI浸染爬片5min后(注意避光)用PBS浸洗爬片3次，每次5min；吸水紙吸干爬片上多余的PBS，用抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

人工智能人才培養要重視應用驅動。當今人工智能已經滲透于各行各業，正不斷提高實體經濟發展的質量和效益。在人才培養過程中要特別重視以應用為導向，在豐富場景下推動人工智能人才的成長。

1.2.6RGCs高糖模型的建立細胞培養2～3d時，對細胞進行換液并隨機將細胞分為正常對照組(5.5mmol/L)及不同葡萄糖濃度(20、25、30、35、40mmol/L)干預的高糖模型組。分別用CCK8及TUNEL檢測換液后連續培養24、48、72h細胞的活力及凋亡率，根據實驗結果，確定葡萄糖干預的最適濃度及干預時間，為后續實驗提供依據。

1.2.7CCK8法檢測原代RGCs的存活率(1)實驗分組：正常對照組(5.5mmol/L)，不同濃度高糖組(20、25、30、35、40mmol/L)。(2)CCK8檢測細胞存活率：原代分離細胞，以5×103個/孔，接種在96孔板上，同時設空白組，37℃培養過夜(在細胞孔周圍孔內加入100μL無菌PBS減少檢測液揮發)。細胞培養3d左右，按照實驗分組加入不同濃度的葡萄糖，空白組加入等體積的細胞培養基，設置3個復孔，在細胞孔周圍加入100μL PBS；分別處理24、48、72h。加入10μL CCK8，37℃，5%CO2培養箱中培養2～4h。加入10μL CCK8，37℃，5%CO2培養箱中培養2～3h。酶標儀測定在波長為450nm下各組的吸光光度值(OD值)，重復3次，取平均值。按照存活率公式：細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%(As：實驗孔；Ac：對照孔；Ab：空白孔)進行計算。

1.2.8TUNEL法檢測原代RGCs的凋亡率(1)在培養板中將已長有細胞的爬片用PBS浸洗3次，每次5min；用4%多聚甲醛固定爬片30min(室溫)，PBS浸洗爬片3次，每次5min。細胞浸入Triton X-100通透液，通透5min(室溫)；隨后，PBS浸洗爬片3次，每次5min。配制TdT酶反應液：每張爬片用量45μL(Equilibration Buffer 加入1.0μL biotin-11-dUTP和4.0μL TdT Enzyme，即用即配，注意避光)。(2)樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50μL TdT酶反應液，放入溫盒中，37℃，避光反應60min，隨后用PBS漂洗3次，每次5min。(3)細胞爬片周圍吸水紙吸干，每張爬片滴加50μL Streptavidin-Fluorescein標記液(Streptavidin-Fluorescein試劑按每張爬片5μL用量與45μL Labeling-Buffer混勻，計算所需的總量后，即用即配，注意避光)放入濕盒，37℃，避光反應30min，隨后用PBS漂洗3次，每次5min，注意避光。(4)用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下(激發波長450～500nm，發射波長515～565nm)觀察采集圖像。熒光顯微鏡下組織切片上凋亡的細胞呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光。通過Image J對細胞凋亡數目進行計數，最終通過公式計算出各組細胞凋亡率。凋亡率(%)=陽性細胞凋亡數/所有細胞總數×100%。

2結果

2.1成功培養SD大鼠原代RGCs 離體培養的RGCs接種在包被好的培養基或培養瓶中立即觀察，細胞呈圓形或橢圓形，可見部分細胞聚集成團，4～6h細胞開始貼壁，大約1d后細胞基本完全貼壁。RGCs培養1d后可見部分胞體聚集生長，并開始漸長出幾十微米的軸突(圖1A)；RGCs培養第2～5d，細胞生長狀態良好，細胞胞體明顯，可見相互交錯成網絡樣的軸突，小片狀融合聚集生長，胞體周圍可見神經細胞特有的光暈(圖1B～E)；培養至6d左右發現細胞開始凋亡(圖1F)；第7～8d可見較多RGCs凋亡，胞質中可見呈凋亡改變的細胞核，存活下來的胞體可見較長的軸突，長度約細胞胞體的5～6倍，軸突之間相互交錯(圖1G、H)。

圖1 倒置顯微物鏡下體外培養1～8d的細胞圖片 A：RGCs體外培養1d；B～E：RGCs體外培養3～5d；F：RGCs體外培養6d；G、H：RGCs體外培養7～8d。

2.2體外純化培養細胞鑒定

2.2.1神經元鑒定甲苯胺藍著染的細胞胞體中可見神經細胞特征性的清晰地著染成藍紫色結構清晰的結節為尼式小體，非神經元細胞胞體不著色，著染神經元陽性率達95%以上(圖2)。

圖2 細胞甲苯胺藍染色染色圖片。

圖3 特異性抗體Thy-1染色結果 A：Thy-1陽性表達于細胞軸突(紅色熒光)；B：DAPI著染細胞核(藍色熒光)；C：細胞形態呈典型的神經元細胞結構，可見軸突相互交錯生長，大部分細胞呈紅藍雙色著染。

圖4 特異性抗體Brn-3a染色結果 A：Brn-3a陽性表達于細胞核(紅色熒光)；B：DAPI著染細胞核(藍色熒光)；C：大部分細胞呈紅藍雙色著染。

2.3CCK8檢測細胞存活率不同濃度葡萄糖分別作用于體外純化培養的RGCs 24、48、72h后，用CCK8法檢測純化培養的RGCs的OD值；不同葡萄糖濃度在不同時間體外純化培養RGCs的OD值差異有統計學意義(P<0.05)，隨著時間及葡萄糖濃度的增加，各組細胞的存活率降低(OD值下降)。在不同葡萄糖濃度干預細胞24h時，各分組之間OD值均小于正常對照組，但與正常對照組相比較OD值大小的差異均無統計學意義(P>0.05)；但隨著時間延長，35、40mmol/L葡萄糖濃度干預RGCs 48h和30、35、40mmol/L干預RGCs 72h時的OD值較正常對照組OD值明顯降低，且與正常對照組相比差異具有統計學意義(均P<0.01)，見表2。

表2 不同葡萄糖濃度在體外純化培養RGCs不同時間點的OD值

2.4TUNEL檢測細胞凋亡通過對TUNEL結果分析(圖5)可見隨著葡萄糖濃度增加及時間延長，RGCs的凋亡數量明顯增加。不同濃度葡萄糖干預細胞48h時，如圖濃度為30、35、40mmol/L細胞凋亡數量(凋亡率)較濃度為5.5mmol/L細胞凋亡數量(凋亡率)明顯增加(圖5)，且差異具有統計學意義(均P<0.05，圖6，表3)。同理，不同濃度葡萄糖干預細胞72h時如圖濃度為30、35、40mmol/L細胞凋亡數目(凋亡率)較濃度為5.5mmol/L細胞凋亡數目(凋亡率)明顯增加，且差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖6，表3。

表3 不同濃度不同時間下細胞凋亡率

圖5 隨著時間延長不同濃度葡萄糖對RGCs凋亡影響 綠色熒光為著染的凋亡細胞。

圖6 各組細胞凋亡率 aP<0.05 vs 5.5mmol/L。

3討論

視網膜發育遵循脊椎動物中保守的神經源性程序，以連續但重疊的波協調多能視網膜祖細胞產生特定類型的細胞。在該程序中，RGCs是第一個生成的細胞類型[1,5]。在視網膜中，RGCs是視網膜神經細胞中唯一輸出神經元，主要將視覺信息進行整合傳到大腦視覺中樞[6]。在哺乳動物中，RGCs及其視神經軸突神經退行性改變是引起嚴重視覺損害的多種疾病的基礎。研究已經發現在糖尿病性視網膜病變早期，在出現視網膜血管病變之前就已經出現了RGCs的變性[7]。青光眼、外傷性視神經損傷，缺血性損傷，脫髓鞘和遺傳性視神經病變等這些病變均會損傷RGCs導致不可逆的視力喪失[8-10〗。RGCs作為多種疾病的靶細胞，為探索各種疾病的發病機制，簡單高效的RGCs體外培養模型的建立尤為重要。在小鼠中，RGCs是最不豐富的視網膜細胞類型之一，僅包含約50 000個細胞[11]，且RGCs為高度分化細胞不會增殖，只能進行原代培養，因此，使得RGCs體外培養難度加大。

有學者在RGCs培養中發現[12]，出生后3～5d大鼠的RGCs存活率低，建議采用胚胎期、生后早期大鼠來進行體外RGCs提取培養，胚胎或新生期組織的神經元連接較弱，因此可以在不造成細胞嚴重損傷的情況下進行分離和培養。且胚胎期及新生期，細胞增殖和分化能力強，但胚胎期的胎鼠，需對孕鼠進行剖腹取胚胎鼠，整個過程無菌操作難度較大，操作及取材困難，因此本實驗選擇1～3d新生SD大鼠來提取RGCs。

原代培養常用的方法有組織塊直接培養法和胰酶消化分散細胞法，其中胰酶消化分散細胞法是目前原代培養RGCs是最常用的方法，尹小磊等[13]采用1.25g/L胰蛋白酶濃度對分離的視網膜進行消化20min。本實驗采用0.25%胰蛋白酶消化15～20min，胰蛋白酶濃度更小，對細胞傷害小，且操作簡單方便。

尼式體或尼式小體是分布于神經細胞胞質內的三角形或者橢圓形小塊狀物質，能被堿性染料如甲苯胺藍、硫堇、亞甲藍和焦油紫等燃料染成紫色，尼式染色常用于神經元的染色，尼式小體的存在和消失是神經細胞是否受損的重要指標。尼式染色也是區別神經細胞及非神經細胞的染色方法。神經元的胞體和樹突中均有尼氏小體，但軸突和軸丘中沒有。在我們離體純化培養的細胞胞體中可看到著染成藍紫色的尼式小體，余軸突為藍色，非神經細胞細胞質幾乎不著染，神經元陽性率在95%以上，證實我們離體純化培養的細胞為神經細胞。

Thy-l可特異表達在嚙齒動物視網膜的RGCs上，而在其他神經元上不表達。Thy-l表達的差異可能反映了RGCs和其他視網膜神經元的功能差異。RGCs與其他視網膜神經元的不同之處在于，它們的軸突是有髓鞘的(盡管嚙齒類動物的軸突不在眼睛內)，它們投射的距離更遠，并且它們能傳導動作電位。Thy-l為RGCs陽性和陰性選擇的有用標記物[14]。目前Thy-l已廣泛用于RGCs標記鑒定及分離純化。Brn-3a是POU(Pit-Oct-Une, POU)家族的轉錄因子，又稱為轉錄因子-1，Brn-3，POU4F1。Brn-3a在鼠類視網膜的發育過程中，尤其無論在體內、體外的神經元分化，均有高表達，Brn-3a在RGCs的存活、分化及軸突延伸發揮著關鍵作用，是RGCs可靠的標記物[15]。總之，無論是Thy-l還是Brn-3a均可證實我們離體純化培養的細胞為RGCs，是比較理想的實驗模型。

長期高血糖，是DR發生發展的重要致病因素，研究表明，體外培養時25～30mmol/L的葡萄糖濃度，可近似地等同于糖尿病時體內的高糖狀態[16]。國外研究建立的神經元高糖模型[17]，葡萄糖濃度多為15～35mmol/L，張鳳久等[18]通過Wister大鼠視網膜神經元高糖模型建立，最終選擇葡萄糖濃度為25mmol/L，與本研究均稍有差異，可能是由實驗動物種屬、使用的培養基、視網膜神經元的純度、實驗環境及條件的不同所導致。本實驗對提取的RGCs在體外培養采用Neurobasal培養基，Liu等[19]研究同樣使用Neurobasal培養基培養視網膜神經元干預，他們最終選擇的葡萄糖最佳干預濃度為35mmol/L。這與本研究結果是一致的。本研究還考慮到神經元的自然死亡，故在細胞培養長至3d左右，予以不同濃度葡萄糖對細胞進行干預，干預時間不超過72h，保證整個實驗觀察過程都處于神經細胞活性最佳的時候，實驗數據更具說服力。

本實驗不同葡萄糖濃度的分別干預培養細胞24、48、72h，CCK8檢測結果提示，隨著時間及葡萄糖濃度的增加，各組細胞的存活率降低。在不同葡萄糖濃度干預24h時，各分組之間OD值均小于正常對照組，但與正常對照組相比較差異無統計學意義(均P>0.05)；但在35、40mmol/L葡萄糖濃度干預RGCs 48h，30、35、40mmol/L葡萄糖濃度干預72h時細胞活力與正常對照組細胞活力相比，差異均具有統計學意義(均P<0.05)。隨著葡萄糖濃度及時間的增加，RGCs凋亡率增加，且與正常對照組相比，葡萄糖濃度為30、35、40mmol/L干預培養RGCs 48、72h，RGCs的凋亡率差異均具有統計學意義(均P<0.05)。過高的葡萄糖濃度和長時間高糖干預都有可能對培養的細胞產生不可預計的影響，故本實驗通過對兩種檢測方法的進行數據分析，最終確定35mmol/L葡萄糖濃度干預RGCs 48h可為有效誘導RGCs建立高糖模型最佳干預濃度及時間。