大豆乳清蛋白與硫酸葡聚糖相互作用及乳化特性研究

王喜波 曹 佳 楊 賽 佟曉紅 呂 博 王 歡

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆乳清廢水是堿溶酸沉法生產大豆分離蛋白(Soybean protein isolate，SPI)過程中的副產物，其中大豆乳清蛋白(Soybean whey protein，SWP)含量最多[1]。大豆乳清蛋白中含有多種生物活性蛋白，主要由分子量較低的2S和7S組成，包括大豆胰蛋白酶抑制劑、β-淀粉酶、凝集素等[2]。大豆乳清蛋白是一種酸溶性蛋白，具有很高的營養價值，可以作為許多配方食品的功能成分[3]。研究發現，天然的大豆乳清蛋白具有較好的溶解性及起泡性，但是其乳化特性很難滿足加工需求，需要進行適當的改性[4]。多糖是一種天然的生物聚合物，能夠通過與蛋白質發生相互作用引起其構象變化，使形成的復合物具有不同的功能特性。

蛋白-多糖復合物在食品領域中具有廣泛的應用，由于特殊的結構、尺寸和組成，其功能性質優于單獨的蛋白或多糖，二者的相互作用對食品乳液體系具有重要作用[5]。研究兩者之間相互作用對設計新型食品具有重要意義，可應用于各種功能性食品開發[6]。文獻[7]研究表明，多糖與蛋白發生相互作用可以改變復合物表面電荷分布并改善界面層厚度，增加液滴的親水性和空間排斥力，從而提高乳液的穩定性。文獻[8]研究了大豆乳清蛋白-可溶性大豆多糖復合物對水包油乳液的穩定作用，發現復合物界面層的存在具有提高O/W乳液抗油滴聚合和相分離的能力。文獻[9]制備了大豆乳清分離蛋白-葫蘆巴膠復合物，與大豆乳清分離蛋白相比，加入葫蘆巴膠能夠改善大豆乳清蛋白的乳化穩定性。硫酸葡聚糖(Dextran sulfate，DS)是含有硫酸鹽基團的聚陰離子多糖，具有良好的溶解性，在肝素替代品及蛋白固定方面已經有所應用[10]。此外，硫酸葡聚糖是一類可降解的、具有生物相容性的聚合物，由于其抗凝血活性，被廣泛應用于生物醫學領域及食品體系[11]。目前的研究主要針對多糖對蛋白理化特性的影響，對硫酸葡聚糖與蛋白的相互作用及其在改善乳化特性中的影響鮮有研究報道。

本文主要研究pH值和蛋白多糖比對大豆乳清蛋白和硫酸葡聚糖相互作用的影響，對復合體系的微觀結構、構象變化及相互作用方式進行分析，并對其乳化活性及乳化穩定性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粕，山東萬得福實業集團有限公司；硫酸葡聚糖，上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，國藥化學試劑有限公司；玉米油，黑龍江省九三集團有限責任公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FD5-3型冷凍干燥機，美國 SIM公司；PHS-3C 型pH計，上海儀電科學儀器有限公司；AL204 型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GL-20M 型高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Infinite M200 Pro 型多功能酶標儀，帝肯(上海)貿易有限公司；Zetasizer Nanozs 90 型電位儀，美國布魯克海文儀器公司；Mastersizer 2000 型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；BX53 型科研級正置顯微成像系統，奧林巴斯(中國)有限公司；ZEISSLSM700 型激光共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司；F2000 型熒光光譜儀，日本日立公司；MAGNA-IR560型傅里葉變換紅外光譜儀，美國 Thermo 儀器股份有限公司；ULTRA-TURRAX T18 型高速分散機，德國 IKA 公司。

1.3 方法

1.3.1大豆乳清蛋白制備

參照文獻[12]的方法。將脫脂豆粕破碎成粉，與去離子水以液料比10 mL/g的比例混合；調節pH值至8.0，攪拌2 h，離心(9 000 r/min，30 min)，收集上清液調節pH值至4.5，攪拌30 min，離心(9 000 r/min，15 min)，取上清液；將上清液pH值調至8.0，離心(9 000 r/min，15 min)，去除不溶性物質，得到大豆乳清溶液。用硫酸銨對大豆乳清溶液進行鹽析(飽和度80%)，離心(9 000 r/min，30 min)，并將得到的沉淀重新溶解于去離子水中，調節溶液pH值為7.0，透析(截留分子質量3 500u，4℃)48 h；凍干制得大豆乳清蛋白。杜馬斯燃燒法測定大豆乳清蛋白的蛋白質質量分數為93.12%。

1.3.2儲備液制備

大豆乳清蛋白儲備液制備：精確稱量2.0 g大豆乳清蛋白，溶于100 mL的磷酸鹽緩沖液(pH值7.0，10 mmol/L)中，于室溫(20℃)下攪拌2 h，大豆乳清蛋白溶液質量濃度為20.0 mg/mL。

硫酸葡聚糖儲備液制備：分別精確稱量一定質量(0.1、0.135、0.2、0.25、0.35、0.5、1.0、2.0 g)的硫酸葡聚糖粉末，溶于100 mL磷酸鹽緩沖液(pH值7.0，10 mmol/L)中，室溫下攪拌2 h，得到質量濃度為1.0、1.35、2.0、2.5、3.35、5.0、10.0、20.0 mg/mL的硫酸葡聚糖溶液。

1.3.3蛋白-多糖復合體系制備

將大豆乳清蛋白溶液和不同濃度的硫酸葡聚糖溶液等體積混合，得到不同蛋白多糖比(SWP與DS質量比，20、15、10、8、6、4、2、1)的大豆乳清蛋白-硫酸葡聚糖混合溶液，室溫下攪拌30 min，其中大豆乳清蛋白質量濃度恒定為10.0 mg/mL，硫酸葡聚糖溶液質量濃度分別為0.5、0.675、1.0、1.25、1.675、2.5、5.0、10.0 mg/mL。用鹽酸調節制備不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的大豆乳清蛋白-硫酸葡聚糖復合體系。

1.3.4蛋白-多糖復合體系ζ-電位測定

參照文獻[13]的方法。采用 Zetasizer Nanozs 90型電位儀測定樣品的ζ-電位。將不同pH值和不同蛋白多糖比的復合體系用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液分別稀釋10倍，樣品中的蛋白質質量濃度為1 mg/mL，上樣體積1 mL，室溫下測定。

1.3.5蛋白-多糖復合體系濁度測定

參照文獻[14]的方法略有改動。將不同pH值、不同蛋白多糖比的樣品溶液用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液分別稀釋10倍，取200 μL于96孔板上，用酶標儀測定樣品在600 nm處的吸光度(濁度)。

1.3.6蛋白-多糖復合體系粒徑測定

參照文獻[13]的方法。分別取pH值為3.5、不同蛋白多糖比的樣品溶液用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，利用Mastersizer 2000 型馬爾文激光粒度儀測定樣品的粒徑。

1.3.7光學顯微鏡觀察

參照文獻[15]的方法。取5 μL樣品于載玻片上，蓋上蓋玻片，10倍光學顯微鏡觀察，圖像通過連接到計算機，用數字圖像處理軟件獲得。

1.3.8激光共聚焦顯微鏡觀察

參照文獻[16]的方法略有改動。將1 mL蛋白-多糖復合物樣品與25 μL 0.01 mg/mL的尼羅藍充分混合，避光保存30 min；將5 μL樣品滴在載玻片上，蓋上蓋玻片密封，平衡2 min后，將樣品放置于載物臺上，用20倍的物鏡觀察樣品分布情況，選擇熒光激發波長為515 nm的氬氪激光。

1.3.9熒光光譜測定

參照文獻[17]的方法。利用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋樣品，在室溫下用熒光分光光度計在激發波長λex=295 nm，發射波長λem=200～500 nm范圍內測定熒光光譜。

1.3.10傅里葉變換紅外光譜測定

參照文獻[18]的方法，稱取樣品1 mg，加入溴化鉀100 mg，充分混勻壓片后在室溫條件下通過紅外光譜掃描測定。在掃描波數譜段400～4 000 cm-1、分辨率4 cm-1條件下掃描64次。

1.3.11乳化活性與乳化穩定性測定

參照文獻[19]的方法略有改動。采用濁度法表征樣品乳化特性。將15 mL樣品溶液和5 mL玉米油混合后，10 000 r/min高速均質處理5 min制備乳液，在距燒杯底部0.5 cm處取50 μL樣品加入1 mg/mL的SDS(十二烷基硫酸鈉)稀釋至5 mL，乳化活性指數和乳化穩定性指數計算公式為

(1)

(2)

式中EAI——乳化活性指數，m2/g

ESI——乳化穩定性指數，min

N——稀釋倍數

A0、A30——0、30 min時的吸光度

C——蛋白質量濃度，g/mL

Φ——乳液中油相所占體積分數

1.4 數據統計分析

每組實驗重復測定3次，采用SPSS 23.0軟件中的方差分析法進行ANOVA顯著性分析，以P<0.05表示差異顯著，通過Origin 2020軟件制圖，采用Peakfit 4.12軟件對紅外圖譜進行擬合處理。

2 結果與分析

2.1 ζ-電位分析

pH值和蛋白多糖比影響復合物的電荷平衡，不同復合體系的電荷關系具有一定的規律性，可以通過ζ-電位測定樣品的表面電荷密度，分析SWP與DS的靜電相互作用。圖1顯示了不同pH值和蛋白多糖比對復合體系ζ-電位的影響。隨著pH值的增加，DS溶液的ζ-電位始終為負值，而復合體系的ζ-電位發生了由正到負的轉變。當pH值小于SWP的pI值時，SWP帶正電荷，兩者發生靜電吸引作用而形成復合物[20]。當pH值大于SWP的pI值時，SWP與DS同時帶負電荷，復合體系的ζ-電位均處于SWP與DS之間，這一現象與文獻[21]的研究結果類似。

隨著DS濃度的增大，復合體系的ζ-電位降低(P<0.05)，等電點向左偏移，當蛋白多糖比為4時，等電點偏移程度最大，在pH值為3.5時復合體系ζ-電位的絕對值較低，此時DS的ζ-電位為-54.6 mV，SWP的ζ-電位為17.84 mV，兩者之間具有較強的靜電相互作用，可形成穩定的復合物。當DS濃度繼續升高，復合體系ζ-電位變化不再顯著，說明電荷達到某種平衡后，游離的SWP與DS的復合程度降低[22]。

2.2 濁度分析

濁度可以直觀反映多糖與蛋白相互作用過程中復合物的形成。SWP-DS復合體系濁度隨pH值變化的曲線如圖2所示，在給定的pH值(2.0～7.0)范圍內，SWP均有良好的溶解性，濁度僅在0～0.1范圍內波動，DS溶液濁度均小于SWP，不同pH值條件下無顯著變化。加入DS后，復合體系的濁度顯著升高，且隨著pH值的增加，復合體系的濁度均呈先升高后下降趨勢(P<0.05)。當pH值為3.0～4.5時，SWP-DS復合體系的濁度顯著升高，結合圖1可知，這主要是由于SWP的ζ-電位由正變負，SWP-DS靜電復合物達到電荷中性，分子間進一步復合形成凝聚物。在pH值升高至5.5的過程中，濁度顯著下降，說明到達臨界點，SWP-DS復合物開始解離形成部分可溶性靜電復合物。在可溶性復合物形成的臨界pH值時，濁度較低且無顯著性變化，復合物由于SWP與DS帶有相同的電荷而發生靜電互斥，阻止了復合物的形成[23]。

隨著DS濃度的升高，復合體系的濁度呈現先增加后減小的趨勢(P<0.05)。當DS濃度較低時，由于復合體系內沒有足夠的負電荷來中和SWP攜帶的正電荷，導致最大濁度較低。當蛋白多糖比為4、6、8時，濁度最大對應的pH值均為3.5，蛋白多糖比為4時濁度達到最大值，為1.125，可能是由于隨著DS濃度增大，達到一定值時SWP所帶正電荷能夠與DS所帶負電荷發生靜電相互作用從而生成更多的復合物[24]。隨著DS濃度的繼續增大，濁度下降，表明DS濃度過高時一定程度上不利于其與SWP發生相互作用，阻礙了復合物的生成[25]。因此，選擇pH值為3.5時對不同蛋白多糖比復合體系的相互作用進行進一步研究。

2.3 平均粒徑分析

平均粒徑是反映復合物聚集狀態的重要指標之一。當pH值為3.5時，SWP與DS形成復合物的平均粒徑如圖3(圖中不同字母表示差異顯著，下同)所示。隨著DS濃度的增加，SWP與DS形成復合物的平均粒徑先增大后減小(P<0.05)，與濁度變化趨勢一致。SWP的平均粒徑為(1 158.20±33.49) nm，蛋白多糖比為4時SWP-DS復合物的平均粒徑為(3 667.25±95.32) nm，為SWP的3.17倍。當DS濃度較低時，只有部分SWP與DS結合，生成的復合物較少，且粒徑較小[26]。隨著DS濃度的增大，復合物的平均粒徑增大，主要是因為SWP和DS發生靜電相互吸引，趨于形成電中性的復合物，復合物之間相互吸附發生聚集導致粒徑增大，說明DS的加入改變了酸性條件下SWP的聚集狀態[27]。隨著DS濃度的繼續增大，復合體系粒徑減小，主要是由于SWP和DS形成可溶性復合物，復合體系帶有大量負電荷，此時分子之間靜電斥力較強，阻止了復合物的進一步聚集[28]。

2.4 光學顯微鏡分析

SWP-DS復合物光學顯微鏡圖像如圖4所示，當蛋白多糖比大于10時，形成的復合物粒徑較小，均勻分布在溶液中。蛋白多糖比由8降到4時，SWP與DS形成更多的復合物，并聚集形成更大體積的團聚物，顆粒之間的界限也逐漸明顯，此時顆粒表面電荷被中和，SWP與DS發生靜電吸引形成結構緊密的復合物。當DS濃度進一步增加，復合物結構逐漸變得疏松，主要是由于此時復合體系中的多糖所帶負電荷相對過量，蛋白之間沒有競爭關系，可以自由結合多糖分子，靜電斥力導致復合物間距加大，因此不容易發生聚集[29]。

2.5 激光共聚焦顯微鏡分析

激光共聚焦顯微鏡從微觀結構解釋了不同蛋白多糖比對SWP與DS相互作用的影響。如圖5所示，蛋白多糖比為20和10時，形成了少量復合物，復合物的粒徑較小且較分散，主要是由于DS含量較少，游離的SWP無法與其形成更多的復合物。當蛋白多糖比為8至4時，體系內形成復合物的粒徑逐漸增大，且形成的復合物結構更加緊密，表明二者之間發生了較強的靜電相互作用。此時，SWP攜帶大量的正電荷，DS和SWP-DS復合物攜帶負電荷，蛋白所帶正電荷需要大量的負電荷與其中和，形成的復合物發生聚集，粒徑進一步增大[30]。當蛋白多糖比為2和1時，形成了結構相對較為松散的復合物，說明體系內形成了部分可溶性復合物，復合物表面帶有大量負電荷，復合體系的ζ-電位逐漸接近于DS，分子之間具有較大的靜電斥力，從而阻止了復合物之間的聚集。

2.6 熒光光譜分析

熒光光譜法是檢測復合體系中蛋白質構象變化以及蛋白與多糖結合強度的有效方法，可以進一步表征SWP與DS的相互作用方式[31]。如圖6所示，SWP的最大熒光峰出現在334 nm處，表明色氨酸存在于蛋白質內部的疏水基團中，被非極性氨基酸包圍[32]。加入DS后，復合體系的熒光強度不斷降低且降幅明顯，說明SWP與DS發生了熒光猝滅。當DS濃度較低時，熒光強度較高，主要是由于帶負電荷的DS僅與部分SWP結合，部分色氨酸暴露于分子表面[33]。隨著DS濃度升高，SWP-DS復合體系的熒光強度繼續降低，這可能是由于SWP與DS通過靜電相互作用形成的復合物結構緊密，且復合物之間發生聚集，芳香族氨基酸被非極性環境所包圍，對蛋白質內源熒光產生的猝滅作用增強導致熒光強度下降[34]。由此說明，SWP與DS之間除了靜電相互作用，還存在疏水相互作用。

2.7 傅里葉變換紅外光譜分析

為進一步分析SWP與DS之間的相互作用及結構變化，測定了DS、SWP和SWP-DS復合物的傅里葉變換紅外光譜。如圖7所示，SWP的特征峰保持不變，SWP-DS復合物在3 000～3 700 cm-1波數處的峰強度發生改變，說明SWP與DS之間為非共價結合[35]。隨著DS濃度的增加，復合物O—H拉伸從3 295.16 cm-1向3 291.78 cm-1偏移，特征峰中峰值的改變可能是由于SWP和DS之間存在氫鍵相互作用[36]。SWP在1 700～1 500 cm-1處的特征峰是酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ振動，表明酰胺鍵的形成。酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)特征吸收峰改變，表明DS對蛋白質的二級結構有明顯影響。SWP-DS復合體系中蛋白質二級結構含量變化如圖8所示，復合物較SWP的α-螺旋相對含量顯著升高，β-轉角相對含量升高，β-折疊和無規卷曲相對含量均減少。α-螺旋和β-轉角代表蛋白質的有序結構，而β-折疊和無規則卷曲代表蛋白質的無序結構，說明SWP與DS形成了結構更加有序且穩定的復合物[37]。隨著DS濃度升高，α-螺旋和β-轉角相對含量呈先升高后降低趨勢，當蛋白多糖比為4時，達到最大值，分別為27%和35%，表明SWP和DS的靜電作用和氫鍵的形成可對蛋白質的α-螺旋結構產生影響，一定濃度的DS使蛋白質二級結構更趨向有序化。

2.8 乳化活性及乳化穩定性分析

不同SWP-DS復合體系的乳化活性指數和乳化穩定性指數如圖9所示。隨著DS濃度的增加，不同復合物的乳化活性呈先增加后降低的趨勢(P<0.05)。當蛋白多糖比為4時，SWP-DS復合物的乳化活性指數達到最大值(55.21±0.57) m2/g，相比SWP提高了31.03%。這可能是由于蛋白多糖比為4時，SWP與DS生成的靜電復合物達到最大值，有利于SWP在油-水界面重排，使SWP表面的親水親油平衡值發生改變，降低界面張力，在一定程度上提高了SWP的乳化活性[38]。當DS濃度繼續增加，乳化活性不再增大，主要是由于過多的DS可能會降低溶液中顆粒的分散性，導致復合物的乳化活性下降[39]。此外，復合物的乳化穩定性指數顯著提高，最大值為(97.13±0.39) min，與SWP相比提高了14.71%。這可能是由于復合物的形成增加了油/水乳化系統中水相的黏度，同時也會降低油/水界面張力，從而提高了乳化穩定性[40]。此外，SWP與DS的相互作用可以使蛋白質分子結構展開，暴露出部分疏水基團，有利于蛋白吸附到油-水界面上，提高乳液的穩定性[41]。

3 結束語

研究了不同pH值和蛋白多糖比對大豆乳清蛋白與硫酸葡聚糖的相互作用方式及乳化特性的影響。ζ-電位和濁度結果表明，SWP和DS通過靜電相互作用形成復合物，當復合體系的pH值為3.5、蛋白多糖比為4時，濁度達到最大值，兩者靜電相互作用最強。熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜說明，DS的加入改變SWP的微環境和二級結構，使蛋白質的二級結構更趨向有序化，SWP-DS復合物的形成是靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用的共同結果。通過平均粒徑和微觀結構結果得出，一定蛋白多糖比有利于形成結構更加穩定的復合物，當蛋白多糖比為4時，復合物的聚集程度最大。乳化特性結果表明，一定濃度的DS有利于SWP在油-水界面重排，能夠顯著改善SWP的乳化活性及乳化穩定性。