電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定氯化銨棕色口服溶液中19種元素的含量

張 敏，姜 瑋，魏明剛，劉江云，姚 鑫，閆兆威*

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇蘇州 215006；2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州 215123；3.泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇泰州 225300；4.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇蘇州 215006)

氯化銨棕色口服溶液是以復(fù)方甘草口服溶液和氯化銨為主要原料配制而成的復(fù)方制劑，臨床上主要用于治療急、慢性支氣管炎及其他原因引起的咳嗽癥狀。中藥制劑中含有多種無機(jī)元素，其中一些無機(jī)元素是人體必需的，是保證人體生長、身體代謝、生理機(jī)能調(diào)控的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。此外，還有一些元素為有害元素，如鉛(Pb)、砷(As)、銅(Cu)等元素如果超標(biāo)，將直接影響患者健康，對身體部分機(jī)能造成損害[2]。現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》中收載的口服液品種項(xiàng)下鮮有對重金屬及其有害元素的限量做出規(guī)定。藥品中元素雜質(zhì)有多個(gè)來源，可能存在于原料藥、輔料，也可能是天然存在的，或是人為引入等。由于元素雜質(zhì)通常沒有治療作用，其在藥品中的含量應(yīng)該被控制在可接受限度內(nèi)，每日的攝入量要低于每日允許暴露量。因此，探索中藥口服液重金屬及其有害元素的檢測方法，并依據(jù)其測定結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，對保證中藥制劑安全用藥和藥品質(zhì)量具有十分重要的意義。

本研究擬參考《中華人民共和國藥典》2020年版中的相關(guān)要求，建立電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測定氯化銨棕色口服溶液中鋰(Li)、硼(B)、鋁(Al)、硅(Si)、鉀(K)、鈣(Ca)、釩(V)、鉻(Cr)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、銅(Cu)、砷(As)、硒(Se)、鉬(Mo)、鈀(Pd)、銻(Sb)、鋇(Ba)、鉛(Pb)19種元素的分析檢測方法，實(shí)現(xiàn)了多種元素的同時(shí)測定。并進(jìn)一步通過主成分分析(principle component analysis,PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)，找出差異顯著的無機(jī)元素及其變化規(guī)律，最終為氯化銨棕色口服溶液重金屬以及安全用藥和質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)，也為其他品種中藥制劑口服液中重金屬以及有害元素的殘留分析提供參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 電感耦合等離子質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；CEM mars5 express微波消解儀(美國培安公司)；XP504電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q Reference超純水處理系統(tǒng)(美國密理博公司)。

1.2 試劑和藥品 單元素溶液對照物質(zhì)：Li(批號20041435)、B(批號20070135)、Al(批號2018122203)、Si(批號20070735)、K(批號20041435)、Ca(批號20070135)、V(批號20041435)、Cr(批號20041435)、Fe(批號20041435)、Co(批號20041435)、Ni(批號20041435)、Cu(批號19052735)、As(批號18111975)、Se(批號20041435)、Mo(批號19052735)、Pd(批號20041435)、Sb(批號2018110803)、Ba(批號19052735)、Pb(批號18081073)購自鋼研納克檢測技術(shù)股份有限公司。65%硝酸購于德國默克公司，鹽酸購于上海國藥化學(xué)試劑有限公司。

氯化銨棕色口服溶液由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供，批號分別為20190724(編號S1)、20190909(編號S2)、20191014(編號S3)、20191021(編號S4)、20191029(編號S5)、20191104(編號S6)、20191111(編號S7)、20191118(編號S8)、20191125(編號S9)、20191202(編號S10)、20200205(編號S11)、20200217(編號S12)、20200302(編號S13)、20200330(編號S14)、20200413(編號S15)、20200511(編號S16)。

2 方 法

2.1 儀器參數(shù) 射頻功率1550 W，蠕動(dòng)泵40 r/min，冷卻氣、輔助氣、霧化氣流量分別為14、1.0、0.989 8 L/min，延遲時(shí)間60 s，采樣深度5.00 mm，掃描次數(shù)為45次，積分時(shí)間0.02 s，重復(fù)測定次數(shù)為3次。按照同位素豐度表推薦的質(zhì)量數(shù)選擇測定時(shí)選取的同位素，分別為：7Li、11B、27Al、29Si、39K、40Ca、51V、52Cr、57Fe、59Co、60Ni、63Cu、75As、77Se、95Mo、105Pd、121Sb、137Ba、208Pb，其中7Li、11B、27Al、29Si、39K、40Ca以45Sc為內(nèi)標(biāo)，51V、52Cr、57Fe、59Co、60Ni、63Cu、75As、77Se、95Mo以72Ge為內(nèi)標(biāo)，105Pd、121Sb、137Ba以125Te作為內(nèi)標(biāo)，208Pb以209Bi為內(nèi)標(biāo)。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品儲(chǔ)備液 分別精密吸取Li、B、Al、V、Cr、Fe、Co、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba、Pb、Ni和Cu單元素溶液對照物質(zhì)1 ml；Si、Ca和K單元素溶液對照物質(zhì)10 ml，置100 ml容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，得多元素對照品儲(chǔ)備液[3]。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 分別精密吸取Sc、Ge、Te、Bi單元素對照溶液250 μl，用5%硝酸溶液稀釋，制成每1 ml含Sc 50 ng，Ge 50 ng，Te 50 ng，Bi 50 ng的混合對照溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密量取氯化銨棕色口服液1 ml，置耐壓耐高溫聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加5 ml硝酸消解，放置過夜，蓋好內(nèi)蓋，旋緊外套，置微波消解爐內(nèi)進(jìn)行消解。消解完全后，待消解液冷卻至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，將消解液轉(zhuǎn)入50 ml量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入1 μg/ml金(Au)對照溶液200 μl，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。除不加Au對照溶液外，同法制備空白溶液。測定鉀(K)元素時(shí)樣品溶液預(yù)先稀釋100倍再行測定[4-5]。

2.3 方法學(xué)考察[6-7]

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對照品儲(chǔ)備液適量，用2%硝酸溶液稀釋，制成混合標(biāo)準(zhǔn)曲線對照品溶液，其中Li、B、Al、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba、Pb的系列濃度為 0、1、2、10、25、50 ng/ml，Si、Ca、K的系列濃度為0、50、100、250、500、1000 ng/ml。

按2.1項(xiàng)下儀器參數(shù)，依次將儀器的樣品管插入各個(gè)濃度的對照品溶液中進(jìn)行測定，以各個(gè)測定元素響應(yīng)值和對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，其濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程與線性范圍見表1。

表1 19種元素的線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、檢出限以及定量限測定結(jié)果Table 1 Determination results of linearity,precision,repeatability,stability,detection limit and quantitation limit of the 19 elements

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取線性關(guān)系中標(biāo)準(zhǔn)曲線第4個(gè)濃度點(diǎn)的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述方法測定，根據(jù)測得值計(jì)算供試品中待測元素的RSD。結(jié)果Li、B、Al、Si、K、Ca、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba和Pb的RSD均≤2.36%(n=6)，表明儀器精密度良好(見表1)。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取氯化銨棕色口服溶液樣品1 ml(編號S1)，按2.2.3項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下儀器參數(shù)條件測定，根據(jù)測得值計(jì)算RSD，結(jié)果Li、B、Al、Si、K、Ca、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba和Pb的RSD均≤2.88%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好(見表1)。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(編號S1)，按2.1項(xiàng)下儀器參數(shù)條件測定，在3 h內(nèi)間隔30 min連續(xù)測定6次，根據(jù)測得值計(jì)算RSD，結(jié)果Li、B、Al、Si、K、Ca、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba和Pb的RSD均≤3.02%(n=6)，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好(見表1)。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次樣品(編號S1)1 ml，精密稱取，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，精密加入多元素混合對照品儲(chǔ)備液適量，按2.2.3項(xiàng)下方法制備溶液，按2.1項(xiàng)下儀器參數(shù)條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果Li、B、Al、Si、K、Ca、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba和Pb的平均加樣回收率分別為(87.66±2.14)%、(93.54±2.88)%、(87.44±2.01)%、(89.58±3.09)%、(96.38±3.17)%、(85.86±2.64)%、(91.47±3.38)%、(94.27±3.41)%、(90.25±2.97)%、(93.77±2.54)%、(94.52±1.47)%、(93.58±2.07)%、(91.47±2.44)%、(93.57±2.46)%、(94.74±2.31)%、(89.57±2.42)%、(89.69±3.07)%、(93.22±2.77)%和(92.11±1.55)%(n=6)，表明此方法準(zhǔn)確性良好。

2.4 檢測限以及定量限 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測定不少于7份的空白樣品溶液，以連續(xù)測定空白樣品溶液響應(yīng)值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(3SD)所對應(yīng)的待測元素濃度作為檢測限；以連續(xù)測定空白溶液響應(yīng)值的10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(10SD)所對應(yīng)的待測元素濃度作為定量限，測定結(jié)果見表1。

2.5 樣品含量測定 精密量取16個(gè)批號的氯化銨棕色口服溶液(編號S1～S16)，按2.2.3項(xiàng)下方法制備溶液，按2.1項(xiàng)下儀器參數(shù)條件測定，結(jié)果見表2。19種測定元素的含量差別較大，Co、Cu、Se、Mo、Pd、Sb、Ba以及Pb等含量較小，Si、K以及Ca含量較高，其他元素含量波動(dòng)較大，且不同批次的樣品中存在一定的差異，如Fe最高含量為2 333 ng/ml，最低1 340 ng/ml。測定結(jié)果根據(jù)《ICH Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則》中規(guī)定的最大暴露量折算，遠(yuǎn)小于規(guī)定的元素雜質(zhì)的每日允許暴露量[8]，說明基于元素考慮，本制劑較為安全。

表2 氯化銨棕色口服溶液中19種無機(jī)元素的含量測定結(jié)果Table 2 Content determination results of the 19 inorganic elements in the Ammonium chloride brown oral liquid (n=3，ρB/ng·ml-1)

利用SIMCA-P 13.0軟件， 對不同批次氯化銨棕色口服溶液樣品中無機(jī)元素含量進(jìn)行主成分分析和偏最小二乘判別分析，主成分分析得分散點(diǎn)圖見圖1。結(jié)果表明不同批次間具有一定的差異，樣品S1、S2、S3和S4聚集為一類(A)，樣品S5、S6、S7、S8和S9聚集為一類(B)，樣品S10、S11、S12、S13聚集為一類(C)，其余樣品聚集為一類(D)，含量不同的具體原因可能是由于每一批次的原料來源不同。

圖1 不同批次氯化銨棕色口服液的主成分分析得分圖Figure 1 Principle component analysis score diagram of different batches of the Ammonium chloride brown oral liquidA:樣品S1～S4;B:樣品S5～S9;C:樣品S10～S13;D:樣品S14～S16

利用偏最小二乘判別分析，并結(jié)合t檢驗(yàn)(P<0.05)進(jìn)一步對不同批次氯化銨棕色口服溶液差異元素進(jìn)行比較，按照變量對分組的貢獻(xiàn)值(VIP)的大小進(jìn)行排列。其中Li、B、K、V、Fe、Ni、As、Mo、Pd元素的VIP>1，表明這幾種元素在不同批次氯化銨棕色口服溶液中的含量差異較大(見圖2)。

3 討 論

在19種待測元素中，F(xiàn)e、Ni、Mo是人體必需的微量元素，Co對人體具有一定的毒性，Ni和Ca屬于微量元素，過量具有一定的毒性；Se是有益的營養(yǎng)元素；Cu、As、Pb屬于有害元素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19種元素均有檢出，通過主成分分析和偏最小二乘判別分析，發(fā)現(xiàn)微量元素之間均有一定的差異。

主成分分析發(fā)現(xiàn)樣品分別聚為四類，具體原因可能是由于原料來源和批次不同。

本研究對氯化鈉棕色口服溶液中重金屬及其有害元素的含量進(jìn)行測定，旨在消除公眾對于中藥有害物質(zhì)的恐慌和誤解。《ICH Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則》中的風(fēng)險(xiǎn)評估模型計(jì)算簡便，靈敏度極高，適用于重金屬元素的分析評估。本研究測定結(jié)果換算成每日最大暴露量，遠(yuǎn)小于該指導(dǎo)原則中規(guī)定的每日允許暴露量。重金屬有害元素風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果表明，基于元素雜質(zhì)限度考慮，本復(fù)方制劑較為安全。