生長激素釋放肽對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用

白 潔，張錦妹，劉麗蘋，王佳妮，孫 雯，楊 帆

0引言

研究顯示，我國糖尿病發(fā)病率約為3%～5%，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病微血管病變中最重要的表現(xiàn)，其發(fā)病率大約占糖尿病患者的30%～60%，其病因與糖尿病患者胰島細(xì)胞代謝異常有關(guān)[1-2]。DR早期癥狀不明顯，伴隨病情進(jìn)展，可出現(xiàn)視力下降、視物變形、眼前黑影飄動等癥狀，因此，早期治療非常重要。生長激素釋放肽(growth hormone releasing peptide，ghrelin)具有提高神經(jīng)元存活率、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抗炎、增強(qiáng)免疫力和抗氧化等生物活性。ghrelin已被證明是治療多種疾病的有效藥物，包括腦組織缺血再灌注、胃腸道間質(zhì)瘤、糖尿病神經(jīng)病變、心肌梗死和肺損傷等[3-4]。在我們之前的工作中，評估了ghrelin對人晶狀體上皮細(xì)胞的抗氧化作用，并證明它能夠吸收入血，通過血眼屏障，可能對白內(nèi)障有治療作用[5]。既然ghrelin對晶狀體有保護(hù)作用，是否對眼部其他組織(視網(wǎng)膜)也能發(fā)揮保護(hù)作用呢，我們查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，尚未找到關(guān)于ghrelin對視網(wǎng)膜組織保護(hù)作用的相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步探索ghrelin對視網(wǎng)膜組織的保護(hù)作用，進(jìn)一步為ghrelin作為臨床藥物在眼部組織的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料生長激素釋放肽(批號：MB11195，大連美侖生物技術(shù)有限公司)，高脂飼料(配方：基礎(chǔ)飼料+15%豬油+20%蔗糖+蛋黃3%，北京小黍有泰生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione Peroxidase，GSH-PX)活性檢測試劑盒丙二醛(malondialedhyde，MDA)活性檢測試劑盒(上海奧陸生物科技有限公司)，ELISA試劑盒(美國Abcam公司)，蘇木精和伊紅(HE)染色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)，TUNEL凋亡檢測試劑盒(美國abcam公司)、DAB顯色劑(上海朝瑞生物科技有限公司)，光學(xué)顯微鏡(Leica A60 S，德國徠卡公司)，透射電鏡(JEM-1000，日本電子株式會社),酶標(biāo)儀(MR-96T，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

實(shí)驗(yàn)動物及分組：清潔級健康SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量220±30g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，動物許可證號:SCXK(黑)2019-001，動物倫理委員會(Institutional Animal Careand Use Committee,IACUC)認(rèn)證批準(zhǔn)該研究方案。隨機(jī)分為正常對照組(普通飼料喂養(yǎng))、模型組、ghrelin組，模型組和ghrelin組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)4wk后，一次性腹腔注射鏈脲菌素60mg/kg，誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，正常對照組大鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水。3d后用血糖儀測定尾靜脈空腹血糖，造模成功標(biāo)準(zhǔn)：72h后空腹血糖≥16.7mmol/L，造模成功后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)6wk。模型組大鼠在注射鏈脲菌素后死亡4只，ghrelin組死亡3只。

1.2方法

1.2.1給藥方法每組各取6只大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ghrelin組每日1次給予ghrelin(100μg/kg)灌胃，對照組及模型組大鼠每日1次給予等體積0.9% Nacl注射液灌胃，連續(xù)給藥2wk。

1.2.2HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)學(xué)變化每組隨機(jī)取3只大鼠，摘除左側(cè)眼球后將部分視網(wǎng)膜組織用4%多聚甲醛固定2h，將5μm的視網(wǎng)膜切片置于載玻片上，梯度酒精沖洗后HE染色，光鏡拍攝圖像。視網(wǎng)膜厚度計(jì)算方法：自視網(wǎng)膜內(nèi)界膜至視網(wǎng)膜色素上皮層垂直高度。

1.2.3TUNEL染色檢測大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡視網(wǎng)膜切片脫蠟后用二甲苯浸洗2次，酒精梯度脫水后加入TUNEL反應(yīng)混合液，濕盒內(nèi)孵育2h，甩干切片并入DAB顯色液，顯微鏡下觀察細(xì)胞核呈棕黃色的為TUNEL陽性，磷酸鹽緩沖液洗切片終止顯色，中性樹膠封片，光鏡拍攝圖像。

1.2.4透射電鏡每組取3只大鼠，摘除左側(cè)眼球后將視網(wǎng)膜組織用2%戊二醛固定24h，醋酸鈾溶液染色，乙醇-丙酮梯度溶液脫水，用檸檬酸鉛-醋酸鈾對制備視網(wǎng)膜的超薄切片(80nm)染色5min，透射電子顯微鏡觀察。

1.2.5檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子表達(dá)取6只大鼠右側(cè)視網(wǎng)膜組織，勻漿后按照試劑盒說明書檢測SOD、GSH-PX及MDA活性；另取部分視網(wǎng)膜用ELISA法檢測細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a，TNF-a)及白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的水平，酶標(biāo)儀測定每孔在450nm處的OD值。

2結(jié)果

2.1SD鼠視網(wǎng)膜組織病理改變對照組視網(wǎng)膜組織完整，結(jié)構(gòu)清晰；模型組視網(wǎng)膜厚度明顯降低，內(nèi)、外核層細(xì)胞排布疏松；ghrelin組視網(wǎng)膜厚度較模型組增加，結(jié)構(gòu)相對規(guī)整(圖1)。對照組、模型組、ghrelin組視網(wǎng)膜厚度分別為411.0±5.77、353.00±6.03、390.00±5.77μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對照組、ghrelin組與模型組視網(wǎng)膜厚度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.948，P=0.002；t=4.433，P=0.011，圖2)。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜組織病理改變(HE) A：對照組；B：模型組；C：ghrelin組。

圖2 三組視網(wǎng)膜厚度的比較 aP<0.05，bP<0.01 vs 模型組。

2.2視網(wǎng)膜TUNEL染色結(jié)果對照組大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層偶見深棕色的TUNEL染色陽性細(xì)胞。模型組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。ghrelin干預(yù)后，TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)量減少(圖3)。

圖3 大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色結(jié)果 箭頭所示為TUNEL染色陽性細(xì)胞。A：對照組；B：模型組；C：ghrelin組。

2.3視網(wǎng)膜色素上皮層透射電鏡觀察對照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，細(xì)胞之間界限清晰。模型組細(xì)胞胞漿空泡化明顯，細(xì)胞膜不完整或破裂，可見大量空泡及脂滴。ghrelin干預(yù)后的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)有所改善，細(xì)胞內(nèi)仍有大量空泡存在(圖4)。

圖4 電鏡觀察RPE層超微結(jié)構(gòu) A：對照組；B：模型組；C：ghrelin組。

2.4鼠視網(wǎng)膜組織中SOD和GSH-PX及MDA相對表達(dá)量與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH-PX活性降低，MDA含量升高(t=35.808、8.823、8.696，均P<0.05)；與對照組比較，ghrelin組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH-PX活性降低，MDA含量升高(t=15.410、6.710、11.770，均P<0.05)；與模型組比較，ghrelin組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH-PX活性升高，MDA含量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.807、3.671、10.600，均P<0.05)，見表1。

表1 各組SD大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH-PX及MDA相對表達(dá)量

2.5各組對大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子水平的比較與對照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥因子ICAM-1、TNF-a及IL-1β表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.450、7.170、46.700，均P<0.05)；與對照組比較，ghrelin組大鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥因子ICAM-1、TNF-a及IL-1β表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.723、6.197、9.634，均P<0.05)；與模型組比較，ghrelin組大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子ICAM-1、TNF-a及IL-1β表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.813、6.183、5.767，均P<0.05)，見表2。

表2 各組SD大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子水平的比較

3討論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，糖尿病患者平均壽命延長，DR的發(fā)病率也隨之增加[6]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M人類2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制，通過腹腔注射鏈脲佐菌素誘發(fā)機(jī)體高血糖，建立糖尿病大鼠模型，研究藥物對視網(wǎng)膜組織的保護(hù)作用。ghrelin是一種內(nèi)源性腦腸肽，人體胃底細(xì)胞可以少量分泌，對人體安全、無毒，保證了藥物的安全性[3,7-8]。ghrelin可減少過氧化氫、高糖等多種病理刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。ghrelin在眼部組織中的抗凋亡作用已有多個研究報道：Liu等[10]已經(jīng)證實(shí)ghrelin可以通過抑制RGC-5細(xì)胞的凋亡和恢復(fù)線粒體功能來保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受魚藤酮的傷害。Shimada等[11]測試了Des-ghrelin對人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)Des-ghrelin可以通過減少ROS生成、增加抗氧化酶(MnSOD和CAT)的表達(dá)來減輕過氧化氫引起的損傷。但是，目前國內(nèi)外尚未見關(guān)于ghrelin對視網(wǎng)膜保護(hù)作用的研究，本實(shí)驗(yàn)以鏈脲菌素誘導(dǎo)的SD大鼠為模型，率先研究了ghrelin對糖尿病鼠視網(wǎng)膜組織的影響，在國內(nèi)外屬于首創(chuàng)。

DR早期最主要的表現(xiàn)為視網(wǎng)膜組織及細(xì)胞的凋亡。我們采用了HE染色、TUNEL染色及透射電鏡三種形態(tài)學(xué)檢查方法觀察視網(wǎng)膜組織的病理結(jié)構(gòu)變化。HE結(jié)果顯示，模型組大鼠視網(wǎng)膜變薄，組織結(jié)構(gòu)不清晰，結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列疏松，表明2型DR大鼠模型造模成功，ghrelin干預(yù)后，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相對規(guī)整，細(xì)胞排列方式得到改善；TUNEL染色可標(biāo)記早期的凋亡細(xì)胞，模型組視網(wǎng)膜內(nèi)核層及外核層出現(xiàn)明顯染色陽性的凋亡細(xì)胞(深棕色類圓形)，而ghrelin組明顯降低，說明ghrelin干預(yù)能夠減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞的凋亡；此外，我們還通過透射電鏡對視網(wǎng)膜色素上皮層細(xì)胞進(jìn)行了更微觀的觀察，以上觀察結(jié)果均提示，高糖破壞了視網(wǎng)膜組織正常結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞及組織凋亡，ghrelin可修復(fù)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變。

控制DR的氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)是治療DR的重要手段之一，機(jī)體長期高糖狀態(tài)使視網(wǎng)膜細(xì)胞處于氧化應(yīng)激環(huán)境[12]。SOD、GSH-PX及MDA是氧化應(yīng)激的標(biāo)志性物質(zhì)，ghrelin組SOD、GSH-PX活性升高，MDA含量顯著降低，說明ghrelin可以對抗氧化因子對視網(wǎng)膜的“攻擊”，降低了視網(wǎng)膜組織的氧化損傷。

炎性因子的表達(dá)水平與DR病情的嚴(yán)重程度正相關(guān)[13]。炎性細(xì)胞因子通過破壞血-視網(wǎng)膜屏障在DR患者視網(wǎng)膜內(nèi)高表達(dá)，促進(jìn)了DR的發(fā)生發(fā)展[14]。ICAM-1是介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的黏附分子，近些年逐漸引起學(xué)者關(guān)注，ICAM-1不僅是疾病嚴(yán)重程度和解剖反應(yīng)的生物標(biāo)志物，而且可能是治療糖尿病性黃斑水腫的一個潛在靶點(diǎn)；TNF-α通過介導(dǎo)促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增加血管通透性，刺激視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血流動力學(xué)異常，從而促進(jìn)DR新生血管的形成；IL-1β參與免疫應(yīng)答并促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，增加缺血后中性粒細(xì)胞的黏附性和趨化性，損害血管內(nèi)皮功能[15]。本實(shí)驗(yàn)中，上述炎癥因子在ghrelin干預(yù)后均明顯降低，一方面證實(shí)了炎癥反應(yīng)在DR中的參與作用，另一方面說明ghrelin可通過降低視網(wǎng)膜組織細(xì)胞炎性因子表達(dá)，緩解糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病理變化的進(jìn)程。

綜上所述，ghrelin治療糖尿病大鼠后，能有效延緩糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的進(jìn)程，其作用機(jī)制與降低氧化應(yīng)激水平、抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。本研究依然存在不足，尚缺乏體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證ghrein對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究；另外，更深層次的機(jī)制學(xué)研究也需要探討。隨著研究內(nèi)容的不斷深入，我們將從更深層次出發(fā)，對ghrelin的生物學(xué)功效進(jìn)一步探討。