miRNA-147靶向調控VEGF對人視網膜色素上皮細胞增殖和凋亡及遷移的影響

陳 方，李 恒，游 慧，邱煜焱，王 寧，陳 微

0引言

增殖性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是一種致盲性疾病，是導致孔源性視網膜脫離手術修復失敗的主要原因。一旦形成，PVR就很難治療。因此，開發預防PVR的方法非常重要。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因是一種人體內自然生成的細胞因子，目前已有研究表明抗VEGF治療可以減輕玻璃體的生物活性預防臨床PVR的形成[1]。

目前越來越多的研究表明人視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞的增殖和上皮-間質轉化參與增殖膜的形成在PVR的發生和發展過程中起重要作用[2-3]。miRNA是新發現通過調控轉錄后基因表達來影響機體功能的一類小分子非編碼RNA，已有證據表明，許多miRNA分子通過RPE增殖、遷移以及凋亡參與PVR的形成，如miRNA-146a和miR-194等[4-5]。miRNA-147是研究報道較多的一種小RNA，在類風濕性關節炎、惡性腫瘤等疾病發生發展中發揮了重要作用[6-7]。但miRNA-147與PVR相關性尚未見報道。本研究前期生物信息學篩查發現，VEGF可能是miRNA-147的靶基因。miRNA-147與VEGF在PVR發生發展過程中是否具有調控作用，有待于進一步探究。因此，以ARPE-19細胞為研究對象，初步探討了miRNA-147靶向調控VEGF對ARPE-19細胞的生物學行為的影響。

1材料和方法

1.1材料主要試劑：ARPE-19細胞系購于上海佰曄生物科技中心。DAB顯色試劑盒、MTT試劑盒、Lipofectamine2000轉染試劑、Trizol購自北京索萊寶科技有限公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司。野生型和突變型的VEGF 3’-UTR雙熒光報告質粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。DMEM、胎牛血清購于美國Gibco公司。miRNA-147模擬物(ATCGTCTTCGTAAAGGCGTGTG)及其對照(AGTTCTTGCACGGAACGTACG)、VEGF抑制劑(GTCATGAAGTTCATGGATG)以及對照(GTGTGGATGAAAGTATGTC)、VEGF過表達(上游：5’-AAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC-3’；下游：5’-AAGCTTATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC-3’)及空載體(上游：5’-TTTATCTCCGTCGGCCTTCT-3’；下游：5’-TTTCCTTTCTCCCCATCTTTG-3’)均由Biomics公司設計合成。兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體及HRP標記羊抗兔二抗購于美國Abcam公司。一步法反轉錄熒光定量試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和轉染及分組將生長狀態良好的對數生長期ARPE-19細胞按照每孔2×105個接種至6孔細胞板上，置于37℃、5% CO2和飽和濕度的培養箱中常規培養。根據轉染試劑Lipofectamine 2000說明書步驟進行轉染，取miRNA-147模擬物及其對照、VEGF抑制劑以及對照組、VEGF過表達及空載體，分別用無血清培養液稀釋至100nmol/L，每孔2mL含有脂質體Lipofectamine 2000轉染液進行轉染，轉染6h后更換培養液，繼續培養48h。實驗分為空白對照組(不處理)、無義miRNA組(轉染mimic NC)、miRNA-147模擬物組(轉染miRNA-147模擬物)、抑制劑陰性對照組(轉染shRNA NC)、VEGF抑制劑組(轉染VEGF抑制劑)、miRNA-147模擬物+空載病毒載體組(miRNA-147模擬物和空載體)和miRNA-147模擬物+VEGF過表達組(轉染miRNA-147模擬物和VEGF過表達)。

1.2.2RT-qPCR實驗檢測各組miRNA-147和VEGFmRNA的表達收集各組轉染48h后的ARPE-19細胞，分別加入TRIzol提取RNA，再參照一步法反轉錄熒光定量試劑盒檢測miRNA-147和VEGF mRNA的表達，以U6和GAPDH為內參。miRNA-147正向：5’-GGGGTGTGTGGAAAT-3’，反向：5’-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’；U6正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。VEGF正向5’-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3’，反向：5’-CCTGGTGAGATCTGGTTC-3’；GAPDH正向：5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’，反向：5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’。RT-qPCR反應程序和反應體系參照說明書。采用2-△△Ct的方法進行相對定量分析。

1.2.3熒光素酶報告基因檢測miRNA-147和VEGF靶向關系將對數生長期的ARPE-19細胞以每孔105個接種至12孔細胞板上，將WT-3’UTR、MUT-3’UTR與miRNA-147模擬物或無義miRNA共轉染至ARPE-19細胞。每組實驗設置3個重復。培養箱內培養48h后，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒步驟檢測熒光素酶活性。

1.2.4Westernblot實驗檢測各組VEGF蛋白的表達收集各組轉染48h后的ARPE-19細胞，分別加入RIPA裂解液并在冰上放置20min，4℃ 13 000r/min離心20min，采用BCA試劑盒測定上清的蛋白含量。取35μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉PVDF膜，用2%BSA封閉液封閉，分別加入一抗(1∶1 000)4℃過夜，以β-actin抗體(1∶10 000)為參照，再加入二抗(1∶10 000)室溫孵育1h。ECL曝光成像，采用Alpha Imager HP凝膠成像系統分析結果。

1.2.5MTT實驗各組細胞培養48h后，每孔加入終濃度為0.5mg/mL MTT。孵育4h后每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，放置酶標儀上波長為570nm下測定吸光度OD值。

1.2.6流式細胞術檢測實驗各組細胞培養48h后，棄細胞培養液。各組取10萬個的細胞加入195μL結合液和Annexin V-FITC 5μL，避光孵育10min，1 000r/min離心5min棄上清，再加入190μL結合液和10μL碘化丙啶染色液，低溫避光放置10min后進行流式細胞儀檢測。

1.2.7細胞劃痕實驗取各組細胞加入孔板中，每孔背后含有5條橫線并含有5×105個細胞。過夜培養后，用200μL的槍頭垂直于背后的橫線劃痕，洗去劃下的細胞。處理24h后，取樣拍照。

2結果

2.1各組ARPE-19細胞miRNA-147表達水平比較空白對照組、無義miRNA組和miRNA-147模擬物組miRNA-147表達水平分別為：1.00±0.14、1.02±0.12、5.39±0.49，各組細胞miRNA-147表達水平比較差異有統計學意義(F=213.102，P<0.05)。與空白對照組和無義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組miRNA-147表達水平顯著升高，差異均有統計學意義(t=17.919、17.838，均P<0.05)，提示ARPE-19細胞miRNA-147轉染成功，見圖1。

圖1 各組ARPE-19細胞miRNA-147表達水平比較 aP<0.05 vs 空白對照組；cP<0.05 vs 無義miRNA組。

2.2各組ARPE-19細胞VEGFmRNA表達水平比較各組細胞VEGF mRNA表達水平比較差異有統計學意義(F=82.445，P<0.05)。與無義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組VEGF mRNA表達水平顯著降低，差異有統計學意義(t=5.980，P<0.05)；與抑制劑陰性對照組相比，VEGF抑制劑組VEGF mRNA表達水平顯著降低，差異有統計學意義(t=8.582，P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組VEGF mRNA表達水平顯著升高，差異有統計學意義(t=17.086，P<0.05)，見表1。

表1 各組ARPE-19細胞各項指標比較

2.3各組ARPE-19細胞VEGF蛋白表達水平比較各組細胞VEGF蛋白表達水平比較差異有統計學意義(F=163.719，P<0.05)。與無義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組VEGF蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(t=11.073，P<0.05)；與抑制劑陰性對照組相比，VEGF抑制劑組VEGF蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(t=17.577，P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組VEGF蛋白表達水平顯著升高，差異有統計學意義(t=20.100，P<0.05)，見表1、圖2。

圖2 各組ARPE-19細胞VEGF蛋白表達水平比較。

2.4雙熒光素酶實驗驗證miRNA-147與VEGF靶向關系雙熒光素酶報告實驗結果發現，miRNA-147和VEGF能夠靶向結合。miRNA-147模擬物能夠顯著抑制VEGF-WT報告載體的熒光素酶活性，差異有統計學意義(t=10.256，P<0.05)；而miRNA-147模擬物對VEGF-MUT報告載體的熒光素酶活性沒有明顯影響，差異無統計學意義(t=0.736，P>0.05)，見圖3。

圖3 miRNA-147靶向調控VEGF的表達 aP<0.05 vs無義miRNA組。

2.5過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞增殖水平的影響48h后各組細胞增殖水平比較差異有統計學意義(F=23.267，P<0.05)。miRNA-147模擬物組細胞增殖水平與無義miRNA組相比顯著降低，差異有統計學意義(t=3.920，P<0.05)；與抑制劑陰性對照組相比，VEGF抑制劑組增殖水平水平顯著降低，差異有統計學意義(t=4.728，P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組增殖水平顯著升高，差異有統計學意義(t=8.608，P<0.05)，見表1。

2.6過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞凋亡水平及細胞周期的改變流式細胞儀檢測結果發現，各組細胞凋亡率、G0/G1期細胞數、S期和G2期細胞數比較差異均有統計學意義(F=128.468，F=140.761，F=24.485，F=25.736，均P<0.05)。與無義miRNA組相比，miRNA-147模擬物組細胞凋亡率、G0/G1期細胞數顯著增加；而S期、G2期細胞數明顯減少，差異均有統計學意義(t=12.446、9.956、3.908、4.007，均P<0.05)；與抑制劑陰性對照組相比，VEGF抑制劑組細胞凋亡率及G0/G1期細胞數為明顯增加，而S期、G2期細胞數明顯減少，差異均有統計學意義(t=13.279、15.089、9.298、4.810，均P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組細胞凋亡率、G0/G1期細胞數減少，而S期、G2期細胞數明顯增加，差異均有統計學意義(t=18.174、19.731、4.815、9.455，均P<0.05)，見表2，圖4、5。

圖4 過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞凋亡水平的影響。

圖5 過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞周期的影響。

表2 各組ARPE-19細胞凋亡率和細胞周期比例比較

2.7過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞遷移能力的影響各組細胞相對劃痕寬度比較差異有統計學意義(F=188.141，P<0.05)。轉染miRNA-147模擬物或轉染VEGF抑制劑后細胞相對劃痕寬度與各自陰性對照組比較均顯著增加，差異均有統計學意義(t=13.388、12.732，均P<0.05)；與miRNA-147模擬物和空載體組相比，miRNA-147模擬物和VEGF過表達組細胞相對劃痕寬度顯著減小，差異有統計學意義(t=25.961，P<0.05)，見表1、圖6。

圖6 過表達miRNA-147或抑制VEGF對ARPE-19細胞遷移能力的影響。

3討論

RPE細胞位于神經視網膜光感受器的最外層，其功能異常、退化或死亡等通常會引起包括PVR在內的多種嚴重視網膜疾病。值得一提的是，RPE細胞的增殖和遷移是PVR的形成的主要原因。目前研究表明在人類視網膜、角膜、晶狀體等眼部組織中已發現上百種miRNA表達，miRNA通過調控下游靶基因，維持眼部組織的正常功能[8]。近年來，miRNA與RPE細胞的關聯成為眼科的研究熱點。如Zhao等[9]研究表明miR-145可以抑制RPE細胞的增殖，誘導其凋亡率。Wang等[10]研究表明miR-182通過靶向間質表皮轉化因子(c-Met)抑制肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)誘導的RPE細胞增殖和遷移增加，改善PVR及其引起的并發癥。Jun等[11]研究表明miR-124可能通過Ras同源家族成員G(RHOG)抑制RPE細胞增殖和遷移，減輕視網膜疾病中纖維血管增生。這提示miRNA可通過抑制RPE細胞的增殖和遷移作為預防PVR疾病發生的靶點。

如今關于miRNA-147的研究大多是關于各類腫瘤細胞，經證實，miRNA-147過表達抑制乳腺癌、肺癌、膠質瘤等腫瘤細胞增殖發揮抑癌作用，而促進食道癌細胞增殖發揮致癌作用[7,12-14]。由此可知，miRNA-147在不同的癌組織中發揮著完全不同的作用。除此之外，Sui等[15]研究表明MicroRNA-147通過抑制同源盒蛋白C6(HOXC6)抑制人肝細胞癌增殖遷移。由此推測miRNA-147有可能參與RPE細胞增殖和遷移。本研究通過脂質體法向RPE細胞中轉染miRNA-147模擬物，結果表明轉染miRNA-147模擬物后RPE細胞凋亡水平顯著增加、而細胞增殖和遷移能力降低。這與推測結論一致，提示miRNA-147在RPE細胞增殖、凋亡和遷移過程中發揮著重要作用，miRNA-147可通過抑制RPE細胞的增殖和遷移作為抑制PVR疾病發展的靶點之一，但其具體的調控機制有待于進一步探究。

VEGF是近年來新發現的一種與血管增殖有關的生長因子，基因位于6號染色體的P12～P21區域，8個外顯子和7個內含子組成，轉錄時可剪接成VEGF121、VEGF165、VEGF145、VEGF206、VEGF189 5種異構體[16]。VEGF在含有血管結構如結膜、虹膜、脈絡膜及視網膜的正常眼組織中表達較低，VEGF與VEGF受體(VEGFRs)結合參與視網膜血管形成，并維持血管內皮細胞活性[17]。VEGF水平升高是許多眼部血管疾病已知的主要原因之一，同時，抗VEGF療法已被常規應用于治療眼血管疾病。Pennock等[1]研究表明VEGF主要通過間接激活血小板來源的生長因子受體的活性，促進玻璃體視網膜病變的增殖，且在兔玻璃體內注射VEGF抑制劑可以預防PVR發生。本研究結果表明，轉染VEGF抑制劑可抑制RPE細胞增殖、遷移，并促進細胞凋亡。這與雷祥等[18]研究結果一致，其研究結果表明丹參酮ⅡA在缺氧條件下通過抑制VEGF的表達抑制RPE細胞增殖，將細胞阻滯在G0/G1期，促進細胞凋亡。

近年來越來越多的證據表明，miRNA可影響VEGF信號通路轉導過程。陳云霞等[19]研究表明，miR-27可能通過調節糖代謝、VEGF過程介導糖尿病視網膜病變的發病及進展。本研究在Targetscan數據查詢發現，VEGF 3’-UTR中存在miRNA-147的目標堿基序列，且RT-qPCR和Western blot分析結果顯示，VEGF在miRNA-147模擬物轉染后下調，由此我們推測miRNA-147對VEGF有靶向調控作用。此外，本研究通過單獨抑制VEGF基因表達實驗顯示，下調VEGF抑制RPE細胞的增殖、遷移，促進細胞凋亡；過表達VEGF可逆轉miRNA-147模擬物對RPE細胞增殖、遷移和凋亡的抑制作用，提示miRNA-147通過靶向VEGF抑制RPE細胞增殖、遷移，并促進細胞凋亡，對PVR的進展發揮重要作用。這與Hu等[20]和Linetsky等[21]研究結果一致。

綜上所述，miRNA-147在RPE細胞增殖、凋亡和遷移過程中發揮著重要作用，其作用機制可能與靶向抑制VEGF表達有關，提示miRNA-147有望成為預防PVR新靶點。