TGF-β1受體ALK1和ALK5在翼狀胬肉和正常結膜組織中的差異表達

張 燦，王 賀，陳冬燕，趙 凱，李明新

0引言

翼狀胬肉是角膜表面一種良性進展性生長的纖維血管組織。翼狀胬肉的主要癥狀為異物感、眼紅和視力模糊，并可導致不規則散光，如果不加以治療，最終會遮擋視軸區角膜引起視力喪失。研究顯示翼狀胬肉的流行病學在不同的國家和地區是不同的，澳大利亞的發病率最低，為3%[1]，而中國白族地區的翼狀胬肉發病率最高，為30%[2]。目前手術切除是治療翼狀胬肉的主要方法，單純切除復發率較高，往往聯合結膜瓣移植、羊膜移植或應用抗代謝藥物。翼狀胬肉的確切病因尚不清楚，據推測，角膜緣干細胞(limbal stem cells, LSCs)的損傷可能是主要的發病因素，上皮向基質的轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)可能在胬肉的生長調控中發揮關鍵作用[3]。

轉化生長因子β-1(transforming growth factor beta-1, TGF-β1)是一種細胞因子，參與多種不同器官的疾病進程，如腎臟、肝臟、肺、皮膚、心臟或血管[4]。經典的TGF-β1信號通路需要與TGF-βⅡ型受體(TβRII)結合，隨后招募具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的TGF-βⅠ型受體(TβRI)，它磷酸化成為Smads蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)，Smads作為轉錄因子進入細胞核激活或抑制特定基因的表達。在不同的TβRI中，起主要作用的是激活素受體樣激酶1(activin receptor-like kinase 1, ALK1)和激活素受體樣激酶5(activin receptor-like kinase 5, ALK5)。

TGF-β信號通路在腫瘤增殖遷移、癲癇、肝腎纖維化的進程中已經得到充分的研究，且有證據表明，ALK1與ALK5兩種受體激活不同的信號通路，在組織器官的病理改變中互為拮抗、互相調節[5]。已有報道與正常結膜相比，胬肉組織高表達TGF-β1[6]，然而TGF-β1相關受體的研究在國內外報道均較少。本研究采用免疫組織化學染色、RT-PCR和Western Blot來研究ALK1、ALK5在胬肉組織和正常結膜組織中的表達，旨在探討TGF-β1相關信號通路在翼狀胬肉發生、發展中的作用機制，為指導臨床治療提供理論依據。

1對象和方法

1.1對象前瞻性研究。本研究選取2020-06/12在徐州醫科大學附屬醫院眼科就診的翼狀胬肉患者進行研究，本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準(No.XYFY2020-KL033-01)，并于中國臨床試驗注冊中心注冊(No.ChiCTR1900027108)，所有患者簽署知情同意書。試驗組為40例(女23例，男17例，年齡39～82歲)經手術切除的翼狀胬肉標本，試驗組納入標準：(1)原發性翼狀胬肉；(2)胬肉頭端侵入角膜緣內側的長度≥2mm。排除標準：(1)其他眼表疾病；(2)眼部手術、外傷史；(3)近期持續局部或全身用藥；(4)大翼狀胬肉(超過角膜直徑的1/3)；(5)假性翼狀胬肉。對照組為40例(女21例，男19例,年齡44～82歲)白內障手術中獲取的正常球結膜標本，對照組納入標準：(1)符合白內障摘除術手術指征；(2)首診白內障；(3)年齡相關性白內障。排除標準:(1)眼部(內眼)手術史、外傷史；(2)眼表、青光眼、眼底疾病等其他眼部病史；(3)自身免疫性疾病史、結締組織病史、內分泌疾病史。兩組間性別、年齡的差異無統計學意義(均P>0.05)。在每組的40例標本中，隨機數字表法選取30例用于ALK1、ALK5免疫組化染色，5例用于RT-PCR檢測mRNA的表達，5例用于Western Blot檢測蛋白的表達。

1.2方法

1.2.1組織病理學和免疫組化評估對翼狀胬肉頭部和正常結膜組織進行組織形態學和免疫組化檢測。所有獲得的組織置于4%多聚甲醛中4℃固定過夜，自動石蠟包埋機包埋，隨后行組織切片。免疫組化染色方法如下：(1)將石蠟包埋過后的組織切片置60℃烘干箱3h，之后置二甲苯溶液脫蠟；(2)梯度酒精洗去二甲苯及水化；(3)用HRP阻斷液室溫孵育1h，去除內源性過氧化物酶活性；(4)滴加用1%BSA配制的一抗：兔抗人ALK1(濃度1∶400，ab68703，英國abcam公司)或兔抗人ALK5(濃度1∶400，ab31013，英國abcam公司)，4℃搖床孵育過夜；(5)滴加過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(預配制，12-348，美國Sigma公司)，4℃孵育 2h；(6)使用DAB顯色液加至標本上，顯色6min；(7)Hoechst(1∶500)染細胞核，1∶1甘油/1×PBS封片；(8)顯微鏡下觀察照相。以上已略去各步驟間PBS清洗過程。染色結果以細胞質內出現棕色顆粒作為陽性表達,切片在光鏡下隨機選擇5個高倍視野,計算陽性率,即5個高倍視野下陽性細胞數占細胞總數的比率并取平均值。

1.2.2RT-PCR法檢測組織中ALK1、ALK5mRNA的表達使用TRIzol RNA提取液抽提胬肉或結膜組織總RNA，使用DNase試劑盒清除殘留的DNA后逆轉錄成cDNA。應用ALK1、ALK5引物擴增相應基因，ALK1上游引物為 5’-AATCGCACCAAGTAGAGCCC-3’，下游引物為5’-GAGGGAAAGACCAGTGGACG-3’，ALK5上游引物為5’-TGGGCTCTGCTTTGTCTCTG-3’，下游引物為5’-TGTGAAGATGGGCAAGACCG-3’；β-actin上游引物為5’-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’，下游引物為5’-GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG-3’。質量分數為2%的瓊脂糖凝膠電泳擴增產物，EB染色，凝膠成像儀拍照。使用Image J軟件分析其條帶灰度值。以β-actin為內參，計算mRNA相對表達量。

1.2.3WesternBlot檢測組織中ALK1、ALK5蛋白的表達手術中獲取的胬肉和結膜樣本置于細胞裂解液中，勻漿機打碎使其充分裂解，離心取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白總量。取胬肉和正常結膜樣本各15μg，按4∶1加入上樣緩沖液，100℃變性3min。在4℃、非還原狀態下行質量分數10% SDS-PAGE 120V電泳2h，將蛋白質轉移至硝酸纖維素濾膜上110mA作用2h，封閉液(1×TBS 50.00mL，Tween 0.25mL，脫脂奶粉2.5g)室溫下封閉硝酸纖維素濾膜的非特異性免疫球蛋白結合位點1h，將濾膜與兔抗人ALK1或ALK5單克隆抗體一抗(1∶800稀釋于封閉液)孵育，4℃振搖過夜，TBST緩沖液(10×TBS 15.00mL，蒸餾水135.00mL，Tween 0.15mL)沖洗濾膜3次，將濾膜轉移至HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶800稀釋于封閉液)中室溫孵育1h。TBST緩沖液再次沖洗濾膜，用ECL發光試劑與硝酸纖維素膜作用3min，在暗室內曝光，X射線顯影。所得條帶經凝膠成像分析系統分析得到的灰度值，以β-actin為內參，計算蛋白相對表達量。

2結果

ALK1免疫組化結果顯示(圖1)：在所有檢測的標本中，正常結膜組ALK1陽性的細胞主要位于結膜上皮基底層，以細胞核深染為主，少量細胞表現為胞漿著染，淺表上皮亦有少量ALK1染色陽性的細胞，結膜基質層未見AKL1表達，在所有層次中，ALK1陽性細胞比率為(5.35±1.75)%。翼狀胬肉組織標本可見幾乎所有的上皮細胞均為ALK1表達陽性，且主要表現為胞漿著染，基質層亦未見ALK1表達，ALK1陽性細胞比率為(12.42±4.64)%，與對照組相比，兩者之間差異有統計學意義(t=-11.244,P<0.05)。

圖1 使用免疫組化檢測ALK1在正常結膜組織和翼狀胬肉組織中的表達 A、B：ALK1表達于正常結膜組織的上皮細胞基底層,以細胞核深染為主，少量細胞表現為胞漿著染；C、D：翼狀胬肉組織標本可見幾乎所有的上皮細胞均為ALK1表達陽性，且主要為胞漿著染。

ALK5免疫組化結果顯示(圖2)：正常結膜組ALK5主要表達于結膜上皮基底層，與ALK1的表達模式相似，但未見胞漿著染，淺表上皮細胞和基質層細胞未見ALK5表達陽性細胞，ALK5陽性細胞比率為(4.27±1.35)%。與對照組相比，翼狀胬肉上皮基底層僅見少量細胞表達ALK5，陽性細胞比率為(1.55±0.86)%，與對照組相比明顯下降，差異有統計學意義(t=11.159,P<0.05)。

圖2 使用免疫組化檢測ALK5在正常結膜組織和翼狀胬肉組織中的表達 A、B：ALK5主要表達于正常結膜組織的上皮細胞基底層,以細胞核深染為主；C、D：翼狀胬肉上皮基底層僅見少量細胞表達ALK5。

RT-PCR及Western Blot結果顯示(圖3)：正常結膜組ALK1 mRNA的相對表達量為0.2±0.1，翼狀胬肉組ALK1 mRNA的表達明顯增加，相對表達量為1.3±0.2，差異有統計學意義(t=7.186,P<0.05)；與之相比，翼狀胬肉組ALK5 mRNA的相對表達量(0.15±0.08)顯著低于正常結膜組(0.6±0.17)，差異有統計學意義(t=4.833,P<0.05)。Western Blot檢測結果與RT-PCR基本一致，ALK1在正常結膜組和翼狀胬肉組的相對表達量分別為0.4±0.1和0.8±0.25，差異有統計學意義(t=3.327,P<0.05)；ALK5的蛋白相對表達量由正常結膜組的0.35±0.13下降為0.05±0.02，差異有統計學意義(t=4.722,P<0.05)。

圖3 RT-PCR及Western Blot檢測ALK1、ALK5mRNA、蛋白在結膜和胬肉組織中的表達(n=5) A：兩組ALK1、ALK5 mRNA表達電泳圖；B：兩組間ALK1、ALK5 mRNA的相對表達量比較;C：兩組ALK1、ALK5 蛋白表達檢測結果；D：兩組間ALK1、ALK5 蛋白的相對表達量差異。aP<0.05 vs 對照組。

3討論

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，病變首先是角膜緣上皮細胞的向心性生長，隨后出現以成纖維細胞活化為特征的鱗狀上皮化生，伴有新生血管生長、炎癥細胞浸潤和細胞外基質重塑。翼狀胬肉的發病機制尚未明確，炎癥反應、氧化應激、細胞增殖和凋亡、EMT都可能參與了翼狀胬肉的發生發展過程[7]。根據翼狀胬肉的生長傾向，有研究表明翼狀胬肉可能是一種增生性疾病，不過這種增生受到機體精確的調控，使其不能像腫瘤組織一樣無限制的生長[8]。在這種調控過程中，TGF-β1信號通路誘導的EMT、肌成纖維細胞的激活可能起到關鍵作用。TGF-β1可以通過其受體控制一系列轉錄因子來促進EMT，這些轉錄因子抑制上皮細胞表型(細胞連接和極性復合物成分)的表達，并增強間充質細胞表型(基質金屬蛋白酶，纖維黏連蛋白、波形蛋白)的表達[9]。

TGF-β1信號通路在眼部的發育、損傷修復和新生血管形成中發揮著重要的作用，李曉文等[10]發現TGF-β1可促進視網膜色素上皮層細胞的增殖、遷移和向成纖維細胞轉化，并能激活細胞內的ALK5、VEGF等信號分子；而在角膜感染或外傷的病理改變中，TGF-β1信號通路也參與調控著炎癥細胞浸潤、成纖維細胞活化、角膜瘢痕形成等各個過程[11]。Wilson等[12]觀察到TGF-β信號通路相關分子在翼狀胬肉中的表達，在角膜緣基質中有TGF-β1的表達，在中央和周圍角膜中TGF-β2和β3的表達。正常結膜組織TGF-β的表達比翼狀胬肉組織弱得多，在三種TGF-β亞型中，TGF-β1在體外培養的翼狀胬肉成纖維細胞中過表達[9]，羊膜可抑制TGF-β受體以及培養的成纖維細胞中TGF-β mRNA的表達[13]，盡管這些研究表明TGF-β本身在翼狀胬肉的纖維血管生長中很重要，但三種TGF-β及其受體在翼狀胬肉中的表達和作用模式尚未完全確定。

ALK是一類絲氨酸-蘇氨酸激酶，作為TGF-β/骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)超家族配體的Ⅰ型細胞表面受體，ALK主要表達于血管內皮細胞，在血管生成和內皮細胞增生遷移中發揮關鍵作用，但在其它類型的細胞中也有表達[14]。TGF-β1與ALK結合后，活化的ALK與不同類型的Smad蛋白形成復合體，激活胞內Smad蛋白磷酸化，磷酸化的Smad離開原復合體，在DNA結合輔助因子的幫助下進入胞核內，與DNA上的Smad結合元件結合，在轉錄因子協同下啟動靶基因的轉錄，以此來調節機體的生理和病理過程[15]。ALK1和ALK5是研究最多的ALK，ALK1下游Smad信號分子主要是Smad1/5/8，ALK5下游主要是Smad2/3。在細胞因子調控網絡中，ALK1/ALK5可能發揮完全不同的作用，比如在腦組織受損時，ALK1-p-Smad1發揮神經保護作用，而ALK5-p-Smad2/3則起到促癲癇發生作用[16]；在培養的人軟骨細胞中，ALK5促進細胞外基質(膠原蛋白、纖維黏連蛋白等)的合成，而ALK1抑制了這一過程，內皮糖蛋白可能參與調控ALK1/ALK5的表達平衡[17]；在培養的大動脈內皮細胞中，ALK5誘導其成為富含肌動蛋白的足體細胞，以促進血管新生，而ALK1抑制這一過程[18]；在硬皮病成纖維細胞中，已有研究表明，ALK1-p-Smad1途徑促進細胞外基質的合成，但在腎成纖維細胞中，高表達Smad2/3反而促進細胞表達更多的Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白[19]。

在已有的研究中，并未報道過TGF-β1受體ALK1和ALK5在翼狀胬肉中的差異表達。我們通過免疫組織化學染色和RT-PCR、Western Blot的方法評估了TGF-β1受體ALK1和ALK5在翼狀胬肉中的表達，結果顯示，與正常結膜相比，翼狀胬肉ALK1的表達明顯增強，而ALK5的表達減弱。ALK1和ALK5主要表達于上皮細胞基底層，這與前述報道中TGF-β信號通路通過誘導EMT促進胬肉的發展相一致。一般認為，翼狀胬肉來源于結膜，與正常結膜的主要區別在于胬肉處于精確調控的增殖狀態，而結膜的新陳代謝處于動態平衡。由于信號通路調控網絡的復雜性，ALK1在胬肉組織，尤其是胬肉上皮細胞的表達增強，或許是胬肉中細胞增殖活化、細胞外基質合成增加、血管新生的原因，亦或是結果。ALK1在胬肉組織中的活化抑制了ALK5的表達，可能是負反饋調節的一種方式，降低了ALK5下游信號分子的激活，具體的調控過程有待于進一步研究。

本研究的不足之處在于：(1)沒有對ALK的上下游信號分子，比如不同類型的Smad在翼狀胬肉與正常結膜中的表達差異進行闡述；(2)本研究在獲取胬肉標本時并未區分胬肉的生長狀態，ALK的表達強度在進展期的胬肉與靜止期的胬肉中或許會有所差別，這代表著胬肉不同活動期在分子生物學層面的精確調控，這或許可以推斷免疫組化結果中ALK在翼狀胬肉中的染色陽性細胞比例有較大的差異的原因，該推論需要進一步實驗加以驗證。

細胞外基質的不同組分體現了成纖維細胞的功能，研究顯示，結膜和胬肉組織的細胞外基質表達是有差異的，主要表現為胬肉組織高表達Ⅰ型膠原蛋白，而正常結膜組織高表達Ⅳ型膠原蛋白，除此之外，胬肉組織中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表達比結膜組織要高得多[20-21]，這種表達差異或許可以通過TGF-β在結膜和胬肉中結合不同的ALK受體，進而激活不同的信號轉導通路進行解釋。有研究表明使用TGF-β受體的抑制劑可以降低翼狀胬肉成纖維細胞中MMP-1的表達，但文中并沒有區分是哪一種類型的TGF-β受體[22]。進一步的研究，比如使用ALK1抑制劑能否抑制胬肉成纖維細胞的激活，甚至誘導其向結膜成纖維細胞轉化，將會是一個有趣的課題。鑒于單純翼狀胬肉切除術后復發率偏高的問題，在翼狀胬肉切除術后，或許可以局部使用ALK1抑制劑以減少成纖維細胞的激活，從而降低復發率，當然由于TGF-β信號通路的復雜性和雙向調節性，有必要進行更深入的分子生物學研究，以期從根本上揭示翼狀胬肉的發病機制，為翼狀胬肉的預防和治療提供新的思路。