熒光染色法對(duì)組織病理診斷棘阿米巴性角膜炎價(jià)值的研究

杜 滿，亓?xí)粤眨瑒?廷，鹿秀海

0引言

棘阿米巴性角膜炎(acanthamoeba keratitis，AK)是一種少見(jiàn)的眼部感染，1970年代由Naginton等[1]和Jones等[2]分別報(bào)道，我國(guó)1992年首次報(bào)道了由棘阿米巴感染引起的角膜炎[3]。國(guó)外報(bào)道AK與配戴被污染的角膜接觸鏡密切相關(guān)，其次是植物及昆蟲外傷。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，AK以農(nóng)民居多，主要與外傷和用污染的水洗眼有關(guān)。目前AK組織病理學(xué)檢查主要應(yīng)用的染色方法為蘇木素-伊紅染色(hemotoxylin-eosin staining,HE staining)和過(guò)碘酸希夫染色(periodic acid-schiff staining, PAS staining)，兩種染色方法可將棘阿米巴包囊染成紅色或紫紅色，從而進(jìn)行診斷。但是在日常工作中發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重感染的角膜組織，其組織溶解壞死嚴(yán)重，并伴有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，棘阿米巴包囊不易被識(shí)別，另外，送檢角膜組織中棘阿米巴含量較少時(shí)也特別容易漏診。

前期研究熒光染色對(duì)真菌性角膜炎診斷效果[4]時(shí)發(fā)現(xiàn)，熒光染色液對(duì)棘阿米巴包囊同樣有很好的顯色效果，棘阿米巴包囊和真菌細(xì)胞壁一樣，也含有纖維素、幾丁質(zhì)和其他含β-1,4-糖苷鍵的碳水化合物。熒光染色液與這些物質(zhì)結(jié)合后，在紫外激發(fā)光(UA濾鏡)下棘阿米巴包囊呈亮綠色熒光，角膜基質(zhì)纖維呈藍(lán)色，背景呈黑色，棘阿米巴包囊的形態(tài)特征清晰可辨。目前國(guó)內(nèi)尚未將這種檢查方法應(yīng)用到組織病理診斷AK，本研究對(duì)手術(shù)切除的感染性角膜炎標(biāo)本分別行HE染色、PAS染色和熒光染色，比較3種染色方法對(duì)AK的診斷效率。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象回顧性研究。收集2015-05/2020-06于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院就診的感染性角膜炎患者的手術(shù)切除標(biāo)本74例75眼。根據(jù)角膜刮片、體外培養(yǎng)和組織病理診斷結(jié)果，將感染性角膜炎分為AK組和非棘阿米巴性角膜炎(non-acanthamoeba keratitis，NAK)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)感染性角膜炎患者經(jīng)角膜刮片、組織培養(yǎng)或病理檢查明確診斷為AK、真菌性角膜炎或細(xì)菌性角膜炎；(2)手術(shù)切除的角膜組織均送病理檢查；(3)所有患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)未明確診斷的感染性角膜炎；(2)病毒性角膜炎患者；(3)送檢組織標(biāo)本太小，無(wú)法完成病理檢查者。本研究經(jīng)山東省眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.SDSYKYY-2016012)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法將手術(shù)切除的角膜組織立即用10%中性福爾馬林充分固定，取材后將角膜組織用乙醇梯度脫水，二甲苯透明和浸蠟，石蠟切片機(jī)行4μm厚切片，切片經(jīng)二甲苯充分脫蠟后流水沖洗。分別行HE、PAS和熒光染色。

1.2.1HE染色蘇木素染色10min，鹽酸酒精分化2s，自來(lái)水洗返藍(lán)，伊紅染色5min，流水稍洗，脫水，透明，封固。

1.2.2PAS染色滴加過(guò)碘酸染液充分覆蓋組織染色10min、水洗，希夫氏染液避光染色20min，傾去染液，直接滴加偏重亞硫酸鈉1min×2次，流水沖洗10min，蘇木素淡染，脫水，透明，封固。

1.2.3熒光染色將熒光染色液直接滴加12滴到載玻片上，使染液充分覆蓋組織，持續(xù)染色1min，將蓋玻片水平放置于載玻片上以減少氣泡產(chǎn)生，濾紙吸去多余染液。

1.2.4查找病原體將染色完成的病理切片分別置于普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下查找病原體，閱片工作由一名主治醫(yī)師和一名副主任醫(yī)師分別獨(dú)立完成，當(dāng)兩人診斷結(jié)果出現(xiàn)分歧時(shí)，以兩人再次共同閱片達(dá)成的一致結(jié)果為準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)分析3種染色方法檢查阿米巴病原體的敏感性和特異性。同一標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，選取同一部位相同倍率視野下，分別計(jì)數(shù)3種染色方法找到阿米巴病原體的數(shù)量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料以M(P25，P75)表示。采用Cohen’s Kappa 檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩位病理醫(yī)師對(duì)相同病理切片閱片結(jié)果的一致性。三種染色方法的敏感性比較采用Cochran’Q檢驗(yàn)，使用Dunn’s檢驗(yàn)(經(jīng)Bonferroni法校正)進(jìn)行事后兩兩比較。診斷效能比較使用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線計(jì)算ROC曲線下面積(area under receiver operating characteristics curve，AUC)。計(jì)數(shù)在同一部位相同倍率視野下，3種染色方法找到棘阿米巴病原體的數(shù)量比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Friedman法，使用Dunn’s檢驗(yàn)(經(jīng)Bonferroni法校正)進(jìn)行事后兩兩比較。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1患者一般情況本研究共收集感染性角膜炎患者74例75眼，其中AK組38例39眼，NAK組36例36眼(其中真菌性角膜炎30例30眼，細(xì)菌性角膜炎6例6眼)。男42例，女32例，年齡9～78(平均48.8±16.2)歲。初發(fā)71例，復(fù)發(fā)3例，復(fù)發(fā)3例均為AK。

2.2不同角膜炎病原體在不同染色方法的鏡下特點(diǎn)

2.2.1AK 組織切片經(jīng)HE染色，觀察到角膜組織呈化膿性炎癥改變，角膜基質(zhì)纖維變性壞死，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，基質(zhì)間可見(jiàn)棘阿米巴包囊，囊壁呈紫紅色，可見(jiàn)雙層壁結(jié)構(gòu)，內(nèi)容物呈紫色，有時(shí)偏位于包囊一側(cè)。PAS染色棘阿米巴包囊表現(xiàn)與HE染色相似，但經(jīng)PAS染色的角膜基質(zhì)纖維和棘阿米巴包囊顏色都較淡，有時(shí)不如HE染色容易分辨。熒光染色后，棘阿米巴的囊壁呈亮綠色熒光，包囊中央的熒光略弱于囊壁的熒光，有時(shí)只可見(jiàn)空的囊壁結(jié)構(gòu)，角膜基質(zhì)纖維呈藍(lán)色，背景黑色(圖1)。

圖1 AK的鏡下特點(diǎn) 同一部位連續(xù)切片染色。A：HE染色棘阿米巴囊壁呈紫紅色(箭頭)，可見(jiàn)雙層壁結(jié)構(gòu)，內(nèi)容物呈紫色；B：PAS染色的棘阿米巴包囊呈紫紅色(箭頭)；C：熒光染色后，棘阿米巴囊壁呈亮綠色熒光(箭頭)，角膜基質(zhì)纖維呈藍(lán)色，背景黑色。

2.2.2真菌性角膜炎HE染色在絕大多數(shù)真菌不著色，很難在受感染的角膜病灶中辨別出真菌菌絲或孢子，PAS染色可以將菌絲壁和孢子染成紫紅色，角膜基質(zhì)呈粉紅色。經(jīng)熒光染色后，真菌菌絲和孢子呈亮藍(lán)綠色熒光，可見(jiàn)菌絲的橫隔及分支，角膜基質(zhì)纖維呈藍(lán)色，背景黑色(圖2)。

圖2 真菌性角膜炎鏡下特點(diǎn) 同一部位連續(xù)切片染色。A：HE染色角膜基質(zhì)變性壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，呈化膿性炎癥改變;B：PAS染色將真菌菌絲和孢子染成紫紅色(箭頭);C：熒光染色后，真菌菌絲和孢子呈亮藍(lán)綠色熒光(箭頭)，角膜基質(zhì)纖維呈藍(lán)色，背景黑色。

2.2.3細(xì)菌性角膜炎病理組織切片使用以上3種染色方法都無(wú)法觀察到細(xì)菌的病原體，HE染色和PAS染色可以觀察角膜受感染的病理變化，熒光染色可以用于排除棘阿米巴或真菌感染(圖3)。

圖3 細(xì)菌性角膜炎鏡下特點(diǎn) 同一部位連續(xù)切片染色。A：HE染色示角膜基質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，呈化膿性炎癥改變；B：PAS染色呈陰性；C：熒光染色未見(jiàn)發(fā)出熒光的病原體。

2.3不同染色方法對(duì)AK診斷的效能比較及閱片醫(yī)師一致性檢驗(yàn)結(jié)果HE染色的敏感性為69%(27/39)、特異性為92%，PAS染色的敏感性為62%(24/39)、特異性為97%，熒光染色的敏感性為95%(37/39)、特異性為97%，對(duì)組織病理應(yīng)用3種染色方法診斷AK的敏感性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3種染色方法對(duì)AK診斷的敏感性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.857，P<0.001)，采用Dunn’s檢驗(yàn)(經(jīng)Bonferroni法校正)進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，HE染色與熒光染色、PAS染色與熒光染色診斷AK的敏感性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003、<0.001)，HE染色與PAS染色診斷AK的敏感性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.978)。3種染色方法的效能指標(biāo)見(jiàn)表1。AUC最大為熒光染色0.960，其次分別為HE染色0.804，PAS染色0.794，3種染色方法的ROC曲線見(jiàn)圖4。

圖4 三種染色方法診斷AK的ROC曲線圖。

表1 三種染色方法診斷AK的效能比較

對(duì)角膜標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，計(jì)數(shù)在同一部位相同倍率視野下，對(duì)3種染色方法找到棘阿米巴病原體的數(shù)量進(jìn)行分析，HE染色找到棘阿米巴包囊個(gè)數(shù)的中位數(shù)為4(0，11)個(gè)，PAS染色找到棘阿米巴包囊個(gè)數(shù)的中位數(shù)為2(0，9)個(gè)，熒光染色找到棘阿米巴包囊個(gè)數(shù)的中位數(shù)為12(3，33)個(gè)，3種染色方法找到棘阿米巴包囊的數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.561，P<0.001)。采用Dunn’s檢驗(yàn)(經(jīng)Bonferroni法校正)進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，HE染色和熒光染色、PAS染色和熒光染色找到棘阿米巴包囊的數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，HE和PAS兩種染色方法找到棘阿米巴包囊的數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.210)，熒光染色的組織病理切片更容易辨別棘阿米巴病原體。

HE染色、PAS染色和熒光染色診斷AK在兩位病理醫(yī)師間表現(xiàn)出較好的一致性，Kappa值分別為0.916、0.875和0.947。

2.4棘阿米巴與其他物質(zhì)的鑒別診斷熒光染色液除了能與棘阿米巴囊壁的成分結(jié)合產(chǎn)生熒光外，在制片過(guò)程中，染液在組織間產(chǎn)生的氣泡，混入的雜質(zhì)都可以產(chǎn)生熒光。用熒光染液進(jìn)行染色封片過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡，其邊緣會(huì)發(fā)出熒光，類似于棘阿米巴的空囊壁，但是這種氣泡大小不一，外形比棘阿米巴包囊圓潤(rùn)，通過(guò)調(diào)節(jié)顯微鏡的細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，將焦點(diǎn)聚焦在氣泡，這時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)氣泡是在組織標(biāo)本上方貼近蓋玻片的位置。制片過(guò)程中也可能會(huì)混入棉絮或其他纖維性雜質(zhì)，但雜質(zhì)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)烈，看不到囊壁樣結(jié)構(gòu)。棘阿米巴包囊還需要與念珠菌的孢子相鑒別，后者體積明顯偏小，呈大小一致的圓形或橢圓形，無(wú)雙層壁結(jié)構(gòu)，成團(tuán)聚集在角膜基質(zhì)纖維間(圖5)。

圖5 棘阿米巴與其他物質(zhì)的鑒別診斷 A：熒光染色示氣泡(箭頭)；B：熒光染色示雜質(zhì)；C：熒光染色示念珠菌孢子。

3討論

AK是一種少見(jiàn)的但具有潛在破壞性的眼部感染，發(fā)病初期癥狀較隱匿，病程相對(duì)緩慢，本研究中AK患者病程平均為57d，比真菌性角膜炎患者和細(xì)菌性角膜炎患者病程長(zhǎng)。國(guó)外研究報(bào)道，AK主要是由配戴被污染的角膜接觸鏡引起[5-6]，其次是角膜表面劃傷、用被污染的水洗眼。社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位較低的人群中AK發(fā)病率較高[7]。在我國(guó)AK主要是由外傷和接觸被污染的水引起[8-9]，在本研究中主要的危險(xiǎn)因素是灰塵及其他異物入眼造成的角膜劃傷，其次是配戴被污染的角膜接觸鏡。

AK的癥狀與其他類型角膜炎相似，常被誤診為單純皰疹病毒性角膜炎、真菌性角膜炎以及細(xì)菌性角膜炎等[10]。如何快速準(zhǔn)確的診斷AK對(duì)指導(dǎo)臨床診治具有重要的意義。體外培養(yǎng)是檢查感染性角膜炎有效的實(shí)驗(yàn)室檢查方法，刮取角膜病灶部位的組織或者用手術(shù)切除的角膜標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，接種在添加大腸埃希菌的無(wú)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)周期為2wk，培養(yǎng)陽(yáng)性率為30%～60%[11-12]。角膜刮片檢查是一種快速、簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)室檢查方法，只需刮取角膜病灶組織涂于載玻片上，然后滴加10% KOH溶液于普通光學(xué)顯微鏡下檢查，相關(guān)報(bào)道陽(yáng)性率為27%[13]，但這種方法需要檢查者有豐富的閱片經(jīng)驗(yàn)，因?yàn)樵谖慈旧臐衿媳鎰e棘阿米巴病原體比較困難，容易與退變的角膜上皮細(xì)胞或單核細(xì)胞混淆，另外，取材質(zhì)量的好壞直接影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。共聚焦顯微鏡是一種無(wú)創(chuàng)性檢查方法[14-16]，分辨率可達(dá)1μm，可以在細(xì)胞水平上對(duì)角膜進(jìn)行觀察，典型的棘阿米巴包囊成雙層壁結(jié)構(gòu)，容易診斷，但是在角膜潰瘍嚴(yán)重的病例，其穿透性差，無(wú)法成像。

對(duì)于因角膜嚴(yán)重感染而行角膜移植手術(shù)的病例，病理組織活檢是重要的檢查方法，它可以明確感染性角膜疾病的類型，直觀的觀察角膜組織的病理生理變化。HE染色是組織病理最常用的染色方法，可以將棘阿米巴囊壁染成紫紅色，內(nèi)容物染成紫色，但是HE染色對(duì)真菌的著色力較差；棘阿米巴包囊在PAS染色下呈紫紅色，與HE染色相似，真菌細(xì)胞壁和孢子也可被染成紫紅色；棘阿米巴包囊和真菌細(xì)胞壁都含有幾丁質(zhì)，屬于一類β-型多糖，可與熒光染色液特異性結(jié)合，形成強(qiáng)的熒光復(fù)合物，使用熒光顯微鏡可以觀察到角膜組織中的病原體。以往研究報(bào)道，組織病理診斷AK的陽(yáng)性率為31%～65%[10]，這與本研究中應(yīng)用HE染色和PAS染色診斷AK的陽(yáng)性率相似。本研究中使用的熒光染色法方便、快捷，組織標(biāo)本充分脫蠟后滴加一滴熒光染液，作用1min便可在熒光顯微鏡下診斷。本研究中，熒光染色法診斷AK的陽(yáng)性率為95%，明顯高于常規(guī)HE染色和PAS染色的陽(yáng)性率。HE染色和PAS染色雖然可以將棘阿米巴囊壁染色，但是檢查者要想準(zhǔn)確鑒別棘阿米巴病原體還需要積累一定的經(jīng)驗(yàn)[17]，而且角膜組織壞死嚴(yán)重并伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)，分辨混在壞死組織中的棘阿米巴病原體就比較困難。有時(shí)組織中棘阿米巴數(shù)量很少，HE染色或PAS染色對(duì)于少量不典型的棘阿米巴包囊很難做出準(zhǔn)確判斷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證熒光染色診斷棘阿米巴病原體的效力，本研究將同一部位相同倍率視野下，分別將三種染色方法所能識(shí)別的棘阿米巴數(shù)量進(jìn)行比較，結(jié)果熒光染色識(shí)別的棘阿米巴數(shù)量明顯多于其他兩種染色方法，熒光染色液可以特異性的與棘阿米巴囊壁成分結(jié)合，在紫外激發(fā)光作用下產(chǎn)生亮綠色熒光，與角膜組織中其他成分形成鮮明的對(duì)比，在壞死嚴(yán)重的病灶區(qū)域，也很容易識(shí)別棘阿米巴病原體。對(duì)于經(jīng)驗(yàn)較少的病理診斷醫(yī)師，應(yīng)用熒光染色也可以容易的識(shí)別組織中的病原體，通過(guò)對(duì)照常規(guī)染色的組織切片，可以進(jìn)一步學(xué)習(xí)和積累診斷經(jīng)驗(yàn)。

但熒光染色技術(shù)也有一些不足之處，首先熒光染色的組織熒光性會(huì)衰減消失，所以染色后要盡快進(jìn)行檢查，并拍取照片留存。而且應(yīng)用熒光染色技術(shù)時(shí)，也要注意一些非特異性染色所造成的影響，如制片過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡、混入的纖維性雜質(zhì)都會(huì)發(fā)出熒光從而影響診斷。另外，棘阿米巴包囊還需要與真菌的孢子相鑒別。

綜上所述，本研究分析了熒光染色技術(shù)在AK診斷中的應(yīng)用價(jià)值，并與其他兩種染色方法進(jìn)行了對(duì)比，該方法可以快速、準(zhǔn)確的識(shí)別阿米巴病原體，并為定量分析組織中棘阿米巴病原體的含量提供客觀依據(jù)。