miR-6886-5p通過調控LASP1表達抑制胃癌細胞的增殖和遷移

湯守元 蘭國玉 黃耿 朱鐘鐘 李新明 羅海平 姜進平

1 鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）胃腸肛腸外科，湖北435000；2 鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）泌尿外科，湖北435000

胃癌是消化道腫瘤中最常見的惡性腫瘤，具有較高的發病率和病死率［1］。胃癌早期癥狀并不明顯，導致胃癌的早期診斷率較低［2］。闡明胃癌發生、發展的分子機制對尋找新的診斷標志物和治療策略具有重要意義。微小RNA（miR）是一種內源性、非編碼、單鏈小分子RNA，廣泛表達于人體細胞［3］。miR通過抑制靶基因的表達，影響細胞的增殖、轉移、凋亡、分化等功能［4］。越來越多的研究證明，miR在腫瘤的發生及發展過程起到關鍵作用［5］。miR-6886-5p是一個新發現的miR，其在腫瘤細胞中的表達和作用鮮有報道。2019 年10 月至2021 年1 月，本研究旨在檢測胃癌細胞株中miR-6886-5p 的表達，探討miR-6886-5p 對胃癌細胞增殖和遷移的影響以及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑 胎牛血清、DMEM 培養基、RPMI-1640培養基購于美國Gibco公司；胃癌細胞株和正常胃黏膜上皮細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；Lipofectamine 3000轉染試劑、實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）試劑盒購于購自美國Invitrogen 公司；淋巴細胞增殖檢測（MTS）試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；LASP1 野 生 型（LASP1-WT）質 粒 及LASP1 突 變 型（LASP1-MT）質粒、miR-NC、miR-6886-5p 模擬物購于上海碧云天生物技術有限公司；所有抗體購于美國BD公司。

1.2 細胞培養和轉染 在37 ℃、5% CO2培養箱中，HS-746T、SGC7901 和GES-1 細胞采用含10%胎牛血清DMEM 培養基培養，BGC823、MGC803采用含10%胎牛血清RPMI-1640 培養基培養。將HS-746T 細胞分為對照組（轉染miR-NC）和miR-6886-5p 組（轉染miR-6886-5p 模擬物），按照Lipofectamine 3000試劑說明書進行轉染。

1.3 qRT-PCR 檢 測miR-6886-5p 和LASP1 mRNA 表達 使用TRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA。建立qRT-PCR 反應體系，miR-6886-5p 表達量以U6 為內參，LASP1 mRNA 表達量以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt方法計算 。 引 物 設 計 如 下 ，GAPDH 正 向 引 物 ：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 引 物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；miR-6886-5p 正向 引 物：5’-AGCCCTCATCTCATCTGC-3’，反 向 引 物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；LASP1 正 向 引 物：5’-TGCGGCAAGATCGTGTATCC-3’，反 向 引 物 ：5’-GCAGTAGGGCTTCTTCTCGTAG-3’；U6 正 向 引 物：5’-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3’，反 向 引 物：5’-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.4 MTS 法檢測HS-746T 細胞增殖水平 將各組HS-746T 細胞接種于96 孔板，進行MTS 法檢測時，每孔加入20 μl MTS 試劑，在培養箱中培養4 h，使用酶標儀測定每孔在450 nm波長處的吸光度（A）值，連續檢測5次。

1.5 劃痕愈合實驗檢測HS-746T 細胞遷移能力 將各組HS-746T 細胞接種于6 孔板，待細胞融合度達95%，使用10 μl 槍頭在孔底劃痕，每孔加入2 ml 不含血清的培養基，于顯微鏡下測量劃痕寬度（W1）。在培養箱中培養24 h后，于顯微鏡下測量劃痕寬度（W2），HS-746T 細胞劃痕愈合率=（W1-W2）/W1×100%。

1.6 生物信息學軟件預測和雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-6886-5p 的靶基因 使用microRNA.org 預測miR-6886-5p 的靶基因，LASP1 可能是miR-6886-5p 的靶基因。將HS-746T 細胞接種于96 孔板，將miR-NC、miR-6886-5p 模擬物與LASP1-WT 或LASP1-MT 共轉染至HS-746T 細胞。培養48 h 后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.7 Western blot 檢測miR-6886-5p 的靶基因蛋白表達 使用RIPA 裂解液提取各組HS-746T 細胞總蛋白，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，使用硝酸纖維素膜轉膜，在5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入一抗在4 ℃孵育過夜，加入二抗在室溫孵育2 h。使用超敏ECL 發光試劑盒進行顯影，比較靶基因蛋白的表達。

1.8 統計學分析 使用SPSS 21.0統計軟件進行分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，兩兩組間比較應用獨立樣本t檢驗，多組間比較應用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌細胞株中miR-6886-5p 的表達 如圖1，正常胃黏膜上皮細胞GES-1 和胃癌細胞株HS-746T、BGC823、MGC803、SGC7901 中miR-6886-5p 的表達分別為（1.08±0.07）、（0.23±0.05）、（0.42±0.02）、（0.69±0.06）和（0.55±0.04）。與GES-1 相比，胃癌細胞株中miR-6886-5p的表達顯著降低（P＜0.05），表達最低的細胞是HS-746T 細胞（P＜0.01），因此選擇HS-746T細胞進行后續實驗。

圖1 胃癌細胞株和正常胃黏膜上皮細胞GES-1 中miR-6886-5p的表達

2.2 各組HS-746T 細胞中miR-6886-5p 的表達 對照組和miR-6886-5p 組中miR-6886-5p 的表達分別為（1.17±0.40）和（9.48±1.10），miR-6886-5p 組是對照組的8.10倍（P＜0.01）。

2.3 miR-6886-5p 對HS-746T 細胞增殖能力的影響如圖2，與對照組相比，miR-6886-5p 組細胞在第3、4、5 天的A值明顯降低（均P＜0.05），提示miR-6886-5p 可抑制HS-746T細胞增殖。

圖2 miR-6886-5p對兩組HS-746T細胞增殖能力的影響

2.4 miR-6886-5p 對HS-746T 細胞遷移能力的影響對照組和miR-6886-5p 組細胞劃痕愈合率分別為（63.42±5.58）%和（27.41±4.87）%。與對照組相比，miR-6886-5p 組細胞劃痕愈合率明顯下降（P＜0.01），提示miR-6886-5p 可抑制HS-746T細胞遷移（圖3）。

圖3 miR-6886-5p對HS-746T細胞遷移能力的影響

2.5 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-6886-5p 的靶基因 雙熒光素酶報告基因實驗顯示（圖4），轉染LASP1-WT 后再轉染miR-6886-5p 的HS-746T 細胞相對熒光素酶活性較再轉染miR-NC 組明顯降低（P＜0.05），提示miR-6886-5p可靶向結合LASP1。

圖4 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-6886-5p 互補結合LASP1基因mRNA 3’UTR

2.6 miR-6886-5p對LASP1 mRNA表達的影響 對照組和miR-6886-5p 組細胞中LASP1 mRNA 的表達分別為（1.10±0.27）和（0.14±0.02），提示miR-6886-5p 可明顯抑制LASP1 mRNA的表達（P＜0.01）。

2.7 LASP1 蛋白及相關蛋白的表達 Western blot 結果表明（圖5），miR-6886-5p組HS-746T細胞LASP1蛋白表達降低，細胞增殖蛋白CDK4 表達降低，細胞遷移蛋白Snail表達降低。

圖5 miR-6886-5p對兩組LASP1蛋白及相關蛋白表達的影響

3 討 論

miR 是近年來胃癌研究領域的熱點［6］。Ding 等［7］研究發現，miR-146b-5p 在胃癌組織中低表達，上調miR-629 表達后胃癌細胞的增殖和遷移被抑制。He 和Zou［8］研究發現，miR-96-5p 在胃癌細胞系和胃癌患者血清中過表達，miR-96-5p 通過直接靶向叉頭框蛋白O3 基因，加速胃癌細胞的增殖。miR-6886-5p 對胃癌增殖和遷移能力的作用尚不明確。本研究顯示，miR-6886-5p 在胃癌細胞株中的表達明顯低于正常胃黏膜上皮細胞，miR-6886-5p 可能表現為抑癌作用。本研究進一步通過MTS法和劃痕愈合實驗顯示，上調miR-6886-5p 可明顯抑制HS-746T 細胞的增殖和遷移能力，miR-6886-5p在胃癌中表現為抑癌作用。

miR 主要通過與靶基因mRNA 不完全配對結合，導致靶基因mRNA 的降解或者抑制其翻譯，下調靶基因的表達［9］。本研究通過生物信息學軟件microRNA.org 預測顯示，miR-6886-5p 的靶基因可能是LASP1。雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實，miR-6886-5p 能夠靶向結合LASP1 mRNA。miR-6886-5p 可能通過調控LASP1 基因表達發揮作用。LASP1基因位于染色體17q21，其翻譯的蛋白屬于肌動蛋白結合蛋白家族［10］。近年來的研究顯示，LASP1 蛋白在胃癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤中呈高表達，LASP1 蛋白能夠促進腫瘤細胞的增殖、遷移等活動［11］。下調LASP1蛋白表達可顯著抑制胃癌細胞的增殖和遷移［12］。本研究通過qRT-PCR和Western blot檢測顯示，轉染miR-6886-5p的HS-746T細胞中LASP1基因的表達明顯下降，表明miR-6886-5p可靶向抑制LASP1基因的表達。同時，細胞增殖蛋白CDK4表達降低，細胞遷移蛋白Snail表達降低，間接表明HS-746T細胞的增殖和遷移能力降低。

綜上所述，miR-6886-5p 在胃癌細胞株中表達下調，過表達miR-6886-5p 可通過靶向抑制LASP1 基因的表達，降低胃癌細胞的增殖和遷移能力。本研究可能為胃癌的診斷和治療提供新的標志物和分子靶點。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。