下調長鏈非編碼RNA FGD5-AS1抑制腎癌細胞增殖和侵襲的機制研究

葉志華 付金倫 桂定文 羅帥 王靜 王小英

1鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）泌尿外科腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 435000；2 鄂東醫療集團黃石市第二醫院外科，湖北435000

腎癌源于腎小管上皮細胞，其發病率在全球范圍內逐年升高［1］。腎癌治療方式主要是手術切除，轉移性腎癌患者對放療和化療均不敏感［2］。探討腎癌增殖和轉移機制對尋找診斷標志物和靶向治療意義重大。lncRNA 是一種非編碼小RNA，缺乏開放閱讀框架［3］。lncRNA 在基因轉錄修飾、轉錄后修飾等方面發揮重要作用，參與心血管疾病、糖尿病、腫瘤等疾病發生和發展［4］。FGD5-AS1是一種新明確的lncRNA。研究表明，FGD5-AS1 在多種腫瘤中發揮明顯的癌基因作用［5］。FGD5-AS1 在腎癌細胞中的表達及對腎癌細胞生物學行為的影響尚不明確。本研究于2020年7月至2021 年2 月通過檢測FGD5-AS1 在腎癌細胞株中的表達，篩選FGD5-AS1 表達最高的腎癌細胞，探討下調FGD5-AS1 對細胞因子信號轉導抑制因子6（suppressor of cytokine signaling 6，SOCS6）表達的調控及對腎癌細胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 所有細胞均購于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所；胎牛血清（FBS）和培養基購于美國Gibco 公司；Lipofectamine 3000 和Matrigel 膠購于美國Invitrogen公司；陰性對照質粒和小干擾siRNA-FGD5-AS1質粒由廣州市銳博生物科技有限公司合成；二苯基溴化四氮唑藍（MTT）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；一抗購于美國Cell Signaling Technology 公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）試劑盒購于日本TaKaRa 公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養和轉染 腎癌細胞786-O、ACHN、A498、OS-RC-2采用含10%FBS的RPMI 1640培養基培養，近端腎小管細胞采用含10% FBS 的DMEM/F12 培養基培養，在37 ℃、5%CO2培養箱培養。ACHN 細胞以6×105個/孔接種于6 孔板，根據Lipofectamine 3000 說明書轉染細胞，分別轉染小干擾siRNA-FGD5-AS1 質粒和陰性對照質粒，命名為實驗組和對照組。

1.3 qRT-PCR 檢 測FGD5-AS1 和SOCS6 mRNA 表 達應用Trizol 法提取總RNA，反轉錄RNA 為cDNA，根據qRT-PCR 試劑盒說明書進行qRT-PCR 擴增。Ct 值利用2-ΔΔCt方法計算，以GAPDH為內參，引物序列見表1。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應的引物序列

1.4 Western blotting 檢測 蛋白提取試劑盒提取兩組腎癌ACHN 細胞總蛋白。分別取50 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 膠電泳，利用聚偏二氯乙烯膜轉膜，利用5%脫脂牛奶封閉，在一抗中孵育12 h，在二抗羊抗兔中孵育3 h，在凝膠成像系統下顯影、拍照。

1.5 MTT 法檢測ACHN 細胞的增殖 兩組腎癌ACHN細胞以5 000 個/孔接種到96 孔板。每孔加入20 μl MTT 試劑孵育4 h，去上清，每孔加入180 μl 二甲基亞砜，酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度（A）值，連續5 d進行MTT檢測。

1.6 Transwell侵襲實驗檢測ACHN細胞的侵襲 預鋪Matrigel膠（濃度15 μg/ml）至小室上室。兩組腎癌ACHN 細胞使用無血清培養基重懸后接種于上室，加入600 μl 含血清培養基至下室。培養32 h，棉簽擦去未穿微孔膜的ACHN細胞。室溫下甲醇固定，室溫下結晶紫染色，在光學顯微鏡（×100）下計數并取均值。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料符合正態分布，以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 qRT-PCR 檢測腎癌細胞中FGD5-AS1 的表達qRT-PCR 檢 測 結 果 顯 示，FGD5-AS1 在786-O、ACHN、A498、OS-RC-2、HK-2 細胞中的表達量分別為（3.92±0.29）、（5.81±0.53）、（1.66±0.18）、（3.03±0.16）和（1.01±0.06）。與HK-2 細胞相比，腎癌細胞中FGD5-AS1 表達均明顯增加（P＜0.05），其中ACHN 細胞增加最為明顯（P＜0.05）。故以ACHN細胞為對象進行后續實驗。

2.2 qRT-PCR 檢測轉染后ACHN 細胞中FGD5-AS1、SOCS6 mRNA 的表達 在ACHN 細胞株中，對照組與實驗組中FGD5-AS1 表達量分別為（1.01±0.09）和（0.20±0.03），差異有統計學意義（t=8.46，P＜0.01）；對照組與實驗組中SOCS6 mRNA 表達量分別為（0.33±0.05）和（1.02±0.13），差異有統計學意義（t=5.05，P＜0.01）。

2.3 Westen blotting 檢測SOCS6 蛋白和NF-κB 信號通路蛋白的相對表達 Western blotting 顯示，與對照組相比，實驗組ACHN 細胞中SOCS6 蛋白表達明顯增加，NF-κB 信號通路蛋白NF-κB、c-Myc、ICAM-1 蛋白表達明顯降低，見圖1。

圖1 Western blotting 檢測兩組SOCS6 蛋白及NF-κB 信號通路蛋白相對表達

2.4 MTT法檢測ACHN細胞的增殖能力 與對照組相比，實驗組轉染FGD5-AS1 后第3 天開始，細胞增殖能力明顯下降（t=3.86，P＜0.05），見圖2。

圖2 FGD5-AS1對腎癌細胞ACHN細胞增殖能力的影響

2.5 Transwell 侵襲實驗檢測ACHN 細胞的侵襲能力對照組和實驗組ACHN 細胞的侵襲細胞數分別為（80.49±10.50）個和（32.29±8.03）個，實驗組侵襲細胞數明顯減少（t=3.65，P＜0.05），這表明FGD5-AS1 可導致ACHN 細胞侵襲能力明顯降低。

3 討 論

lncRNA 主要通過RNA聚合酶Ⅱ的作用合成，一直以來被研究者們認定為轉錄中產生的“噪音”，不發揮任何生物學效應［5］。近來研究不斷證實，lncRNA 在調控細胞生物學功能方面發揮著巨大的潛力，越來越多lncRNA 被鑒定在腎癌組織或細胞中異常高表達或者低表達，嚴重影響腎癌細胞的生長和轉移［6］。FGD5-AS1 是一種新明確的lncRNA，被發現在多個腫瘤中發揮明顯的癌基因作用［7］。FGD5-AS1在腎癌中的表達模式和分子機制尚不清楚。

本研究顯示，FGD5-AS1 在腎癌細胞株中相對表達明顯高于近端腎小管細胞，FGD5-AS1 高表達可能參與腎癌發生和發展。SOCS6 基因位于人的18q22.2 染色體，其由535 個氨基酸排列組成［8］。SOCS6 蛋白是一種E3 泛素連接酶，通過泛素化降解特定基因表達，從而負調控細胞信號轉導［9］。SOCS6 蛋白在膀胱癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤呈現出明顯的低表達趨勢，展現出明顯抑癌基因作用［10］。有研究表明，FGD5-AS1 在牙周膜細胞中具有調控SOCS6 基因表達的作用［7］。本研究結果表明，下調FGD5-AS1可明顯促進SOCS6基因的表達。NF-κB 信號通路的異常激活與腎癌發生、發展密切相關，其可明顯促進腎癌細胞的生長、轉移等生物學行為［11］。本研究顯示，SOCS6 蛋白表達增加后，NF-κB 信號通路蛋白表達明顯降低，表明NF-κB 信號通路的轉導被抑制。本研究進一步通過MTT 法和Transwell 侵襲實驗表明，下調FGD5-AS1 后，腎癌細胞的增殖和侵襲能力均呈現顯著降低趨勢。本研究的不足之處在于，FGD5-AS1 調控SOCS6 基因表達的具體機制尚不清楚，是本課題組下一步研究的重點。

總之，FGD5-AS1 在腎癌細胞株中高表達，下調FGD5-AS1 可通過正向調控SOCS6 基因表達、負向調控NF-κB 信號通路轉導，抑制腎癌細胞增殖和侵襲。FGD5-AS1 的研究可能為腎癌的分子診斷、靶向治療等提供新的思路。