泡菜和紅棗表面乳酸菌的分離鑒定及抗氧化活性的研究

陳奕帆，賀奕森，唐濤，王真，單春會，趙山山，郝光飛*

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲056038；2.石河子大學，新疆石河子832003）

近年來，乳酸菌作為一種具有保健功能的優質天然抗氧化劑備受關注。有研究表明，乳酸菌可控制腸道微生態平衡，并有較好的抗氧化性和疏水性，能夠提高糖苷型大豆異黃酮的轉化率[1]，較高的抗氧化活性具有預防和治療氧化損傷、清除自由基、抑制脂質過氧化物的形成等重要生理功能[2]，因此在發酵制品中廣泛應用。而乳酸菌發酵制品中，發酵飲料是功能性食品研究熱點，乳酸菌作為發酵飲料的關鍵因素之一，不僅能改善發酵飲料的營養、風味，一些功能獨特的乳酸菌還可用于提高發酵飲料功能性，如副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）YJ1使發酵樹莓汁中總黃酮和總酚含量分別增加了23.00%、18.58%，DPPH自由基和羥基自由基清除能力分別提高了22.92%、15.63%[3]；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）發酵的黃瓜牛奶復合物其羥基自由基清除率達87%，DPPH自由基清除率達85.12%[4]。

紅棗原產于中國并廣泛栽培，其含有豐富的營養物質，具有極高的食用價值和藥用價值，在傳統中醫理論中具有補氣、養生、安神等功能[5]。近年來研究發現紅棗中的多糖、多酚和三萜類化合物具有延緩衰老、提高人體免疫力等多種生理功效[6]，并含有多種對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基清除效果優良的抗氧化性物質[7]。豐富的功能性使紅棗開發與利用熱度持續升高，其中發酵紅棗制品逐漸受到廣大消費者的青睞，但發酵過程中出現發酵能力較差、發酵后抗氧化性降低等問題使其品質及產量受到限制，有必要進一步開發能夠穩定提升品質及抗氧化活性的發酵劑，乳酸菌發酵能夠提高飲料的抗氧化活性、改善果汁風味、提高口感及品質，且具有多種益生功能[8]；另外，乳酸菌發酵能夠產生抗壞血酸等新的抗氧化活性物質，同時提高羥基自由基和DPPH自由基的清除能力[9]。將紅棗汁與乳酸菌結合發酵，以期能夠穩定提升紅棗發酵汁的品質及抗氧化活性。

因此，本研究擬從紅棗表面和泡菜中分離出乳酸菌，從產酸、抗氧化活性、發酵能力3個方面篩選出能夠提升發酵紅棗汁抗氧化活性、改善其風味品質的乳酸菌，豐富發酵紅棗汁專用菌種資源，解決缺少紅棗汁發酵專用菌株及紅棗加工產品單一的問題，為乳酸菌發酵紅棗汁的生產提供理論支持。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

泡菜：河北、云南、四川地區的自然發酵泡菜；紅棗：采自新疆和田地區、河北省滄州地區。

1.1.2 培養基

MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；接觸酶試驗培養基、明膠液化培養基、硝酸鹽還原試驗培養基、H2S產生試驗培養基：國藥集團化學試劑有限公司；糖發酵培養基：上海晶純試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ZHPW-70臺式振蕩培養箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；Microfuge 20高速離心機：美國貝克曼庫爾特公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；UV-1901紫外可見分光光度計：杭州艾普儀器設備有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；T100 Thermal Cycler聚合酶鏈式反應儀、Power pac2000電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；2，2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid）diammoniumsalt，ABTS]法總抗氧化能力檢測試劑盒、鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法總抗氧化能力檢測試劑盒：碧云天生物技術研究所。

2 方法

2.1 乳酸菌的分離純化

2.1.1 紅棗樣品中乳酸菌的分離純化

按照參考文獻[10-11]的方法略加修改，將紅棗樣品浸泡在無菌生理鹽水中，37℃、170 r/min條件下培養30 min，經梯度稀釋后每個梯度取200 μL菌液澆注于CaCO3-MRS瓊脂培養基（含1.5%碳酸鈣的MRS培養基）中，37℃下倒置培養48 h。挑取溶鈣圈直徑較大、菌落圓形突起且邊緣光滑的單菌落轉接到MRS平板上劃線，純化培養3次，將單菌落轉接至MRS肉湯培養基中，37℃培養24 h后，保種及備用。

2.1.2 泡菜樣品中乳酸菌的分離純化

按照參考文獻[10]中的方法對泡菜中乳酸菌進行分離。

2.2 高產酸菌株篩選

按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[12]中的方法，測定菌株產酸能力。

2.3 生理生化試驗

將分離純化的菌株進行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗，篩選出革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株進行硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗和糖發酵試驗，試驗結果對照《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）[13]、《乳酸菌細菌的分類鑒定及實驗方法》[14]進行的綜合判定。

2.4 基因序列檢測及其系統發育樹的構建

按照DNA提取試劑盒說明方法提取的菌株DNA為模板，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體系（25 μL）：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）混合物 12.5μL，DNA 模板 1 μL，正向引物（5'-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3'）、反向引物（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）各 1 μL，無酶水 9.5 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性5 min；94℃變性 30 s，42℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，30個循環；72℃終延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行測序，經同源序列比對分析，采用MEGA5.0軟件構建系統發育樹[15]。

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定按照參考文獻[16]中方法測定DPPH自由基清除率。

2.5.2 羥基自由基清除能力的測定按照參考文獻[17]中方法測定羥基自由基清除率。

2.5.3 ABTS+自由基清除率測定ABTS+自由基清除率按照試劑盒操作要求測定。

2.5.4 FRAP法測定總抗氧化能力FRAP值按照試劑盒操作要求測定。

2.6 優良菌株發酵能力的測定

將高產酸、高抗氧化活性的乳酸菌活化后，5 000 r/min離心2 min，無菌生理鹽水清洗菌體，以5%的接種量、菌體濃度為1×108cfu/mL接種于經過去核、破碎、以 1∶6（g/mL）料液比打漿處理的紅棗汁中[18]，37 ℃發酵72 h后以酸堿滴定法[19]測定酸度并進行感官評價[20]，每組試驗3個平行，選擇綜合效果最優的作為紅棗汁發酵菌株。

2.7 感官評定

由10名專業人員組成評定小組從色澤、香氣、口感、組織狀態4個方面對紅棗汁的感官質量進行評價，每項滿分為9分，評分標準見表1。

表1 感官評定評分標準Table 1 Criteria for sensory assessment

3 結果與分析

3.1 高產酸菌株的分離篩選

從樣品中分離出176株產酸細菌，挑選溶鈣圈直徑較大、菌落圓形突起、乳白色、濕潤且表面光滑的10株菌株（泡菜分離菌株以ZC命名，紅棗表面分離菌株以PC命名）進行產酸試驗，產酸量見表2。

表2 高產酸菌株的篩選結果Table 2 Screening results of high acid-producing strains

由表 2 可知，ZC2、ZC4、PC9、PC11 的產酸量顯著高于其它菌株（P＜0.05），確定為高產酸菌株。

3.2 形態鑒定及生理生化試驗結果

10株產酸菌株均為革蘭氏陽性（G+）、無芽孢、過氧化氫酶陰性的短桿狀菌株，生化試驗表明，10株菌株滿足乳酸菌無運動性、不產生氣體、不液化明膠、不還原硝酸鹽、不產生吲哚及H2S，可以發酵蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、核糖、纖維二糖、棉籽糖、海藻糖、木糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、七葉靈、苦杏仁苷和水楊苷的特性，初步鑒定這10株菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

3.3 基因序列檢測及系統發育樹的構建

乳酸菌的形態學鑒定只能初步判斷表型特征相似，并不代表基因型親緣關系相近，基因型特征需進一步鑒定。經同源性比對后系統發育樹構建結果見圖1。

圖1 基于16S rDNA基因的10株菌株系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 10 strains based on 16S rDNA gene

菌株 ZC1、ZC2、ZC4、ZC5、PC8、PC9 與 Lactobacillus plantarum KGP_PME_01-07的同源性分別為99.34%、99.62%、99.76%、99.89%、99.93%、99.73%，菌株 ZC3、PC11、PC12、PC14 與 Lactobacillus plantarum HBUAS52372 的同源性分別為99.36%、100%、99.57%、99.34%，因此將這10株菌株鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

3.4 抗氧化活性

DPPH自由基及羥基自由基清除率是評價抗氧化性能的重要指標，在一定程度上反映菌株的抗氧化能力[21]，乳酸菌不同菌株之間的抗氧化活性具有較大差異。圖2為不同乳酸菌發酵紅棗汁對DPPH自由基及羥基自由基的清除能力。

圖2 不同菌株發酵紅棗汁抗氧化能力的比較Fig.2 Comparison of antioxidant activity in red date juice fermented by different strains

由圖2可知，10株乳酸菌發酵紅棗汁對DPPH自由基清除能力較強的菌株依次為ZC2＞PC9＞PC11＞PC14，其清除能力分別達到90.62%、87.82%、86.32%和74.91%；10株乳酸菌發酵紅棗汁對羥基自由基清除能力不同，其中清除能力最強的菌株為PC9，其次是菌株PC11、ZC2和ZC4，清除率分別為 67.85%、63.78%、62.48%和59.48%。綜合分析DPPH自由基及羥基自由基清除能力發現，菌株 ZC2、ZC4、PC9、PC11 發酵的紅棗汁清除DPPH自由基和羥基自由基的能力均比較強。

3.5 優良菌株發酵能力測定

將高產酸、高抗氧化活性的4株優良菌株接種于紅棗汁中，發酵結果見圖3，感官評價結果見表3。

圖3 不同菌株對發酵紅棗汁酸度的影響Fig.3 Effects of different strains on acidity of fermented red date juice

表3 不同菌株發酵的紅棗汁感官評分結果Table 3 Sensory scoring results of red date juice fermented by different strains

由圖3可知，4株乳酸菌發酵過程中0～12 h發酵速率緩慢；12 h～60 h發酵速率提升較快，酸度上升明顯；60 h～72 h整體酸度提高，但過高的酸度會不同程度上抑制發酵，發酵速率趨于平緩，酸度緩慢增高，其中菌株ZC4、PC9發酵的紅棗汁酸度提升速率較快，相比于ZC2、PC11能更快增大發酵體系的酸度。

結合表3可知，紅棗表面分離菌株整體感官評分優于泡菜分離菌株，其中菌株ZC4發酵的紅棗汁過高的酸度影響紅棗汁的口感及風味，菌株ZC2發酵后的紅棗汁酸度過低，導致發酵香味與紅棗香味不協調。菌株PC9發酵的紅棗汁酸甜可口、組織細膩，具有紅棗的香氣，菌株PC11與PC9相比發酵不充分導致口感評分較差，且PC9發酵速率大于PC11。結合發酵紅棗汁的產酸量與感官評分結果，PC9具有作為發酵紅棗汁專用菌株的潛力。

3.6 發酵前后紅棗汁抗氧化活性變化

將菌株PC9以5%接種量（菌體濃度為1×108cfu/mL）接入紅棗汁中37℃發酵72 h，測定發酵紅棗汁的抗氧化活性，結果見表4。

表4 發酵紅棗汁的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of fermented red date juice

與未發酵的紅棗汁相比，DPPH自由基、羥基自由基的清除率顯著增加，其DPPH自由基清除率提升了21.52%，羥基自由基清除率提升了15.19%。發酵后紅棗汁ABTS+自由基清除率提高了23.73%；FRAP提高了19.37%。

4 結論與討論

本研究以新疆和田地區、河北省滄州地區的紅棗以及河北、云南、四川地區的自然發酵泡菜為樣品分離出對DPPH自由基及羥基自由基都有不同程度清除能力的10株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），并篩選出高產酸、高抗氧化活性的4株植物乳桿菌ZC2、ZC4、PC9、PC11應用于紅棗汁的發酵，結合發酵紅棗汁的酸度及感官評價結果發現紅棗表面分離菌株PC9的發酵效果最佳。有研究表明，在番茄中分離的乳酸菌與同屬外來菌株同時發酵番茄，番茄分離菌株發酵飲料有更高抗壞血酸、谷胱甘肽和總抗氧化活性[22]；菠蘿中篩選出的乳酸菌應用于菠蘿發酵后與同屬外來菌株相比抗氧化活性最高，色澤保存及香氣更好[22]，這表明紅棗表面分離的菌株具有更高的抗氧化活性，且與未發酵紅棗汁相比，發酵紅棗汁DPPH自由基和羥基自由基清除能力分別提高了21.52%、15.19%，ABTS+自由基清除率和FRAP分別增加了23.73%、19.37%，并能顯著提高紅棗汁風味口感。因此紅棗表面分離菌株具有作為發酵紅棗汁專用菌株的潛在優勢，一方面可以顯著提高食品DPPH自由基、羥基自由基清除率，另一方面還可以提升發酵食品風味及營養，為紅棗表面分離乳酸菌的研究提供了一定的理論依據，可作為新的研究方向進一步開發。