HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定天麻中天麻素、葡萄糖、果糖和蔗糖含量

吳國(guó)真，王新茗，王曉，劉大會(huì)，董紅敬*，耿巖玲，段文娟，李佳

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250300；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省分析測(cè)試中心，山東濟(jì)南250014；3.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）藥學(xué)院，山東濟(jì)南250301；4.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430065）

天麻（Gastrodia elata Blume）為蘭科植物天麻的干燥塊莖，又名“赤箭”，為藥食兩用植物，主要通過(guò)密環(huán)菌菌株進(jìn)行人工栽培[1]，當(dāng)前已發(fā)展形成云南昭通、陜西漢中、貴州大方等天麻主流產(chǎn)區(qū)[2]。天麻在中醫(yī)臨床上具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)的傳統(tǒng)功效[3]，在民間具有悠久的食用歷史，早在唐代著名詩(shī)人白居易《齋居》中就有“黃芪數(shù)匙粥，赤箭一甌湯”的記載[4]。在現(xiàn)代，天麻具有天麻燉雞、天麻泡酒、天麻火鍋、天麻蜜餞等多種吃法，是云南、貴州等地居民的常用食材[5-6]。同時(shí)，天麻已被開(kāi)發(fā)加工成天麻咀嚼片、天麻保健飲品、天麻保健酒等多種功能食品[7-9]。

天麻富含多酚以及糖類(lèi)等多種生物功能性物質(zhì)[10]，其中天麻素為天麻中的主要多酚類(lèi)成分，具有改善海馬區(qū)多巴胺系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)元、減輕細(xì)胞損傷、改善記憶障礙等多種生物活性[11-13]，常被用于評(píng)價(jià)天麻的品質(zhì)。天麻中糖類(lèi)成分主要有多糖、低聚糖、二糖和單糖等[14-15]，不同的糖類(lèi)成分會(huì)承載不同的甜味，同時(shí)單糖和二糖能夠與基質(zhì)中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合，可不同程度地抑制風(fēng)味的釋放，從而影響食品的最終風(fēng)味[16-17]。因此除了關(guān)注天麻中天麻素等功能性成分的含量，天麻中單糖、二糖類(lèi)成分的含量對(duì)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地天麻的口感、風(fēng)味及品質(zhì)的評(píng)價(jià)具有重要的意義。

當(dāng)前研究多采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定天麻素成分的含量[18-19]、苯酚-硫酸法測(cè)定天麻多糖含量[20-21]評(píng)價(jià)天麻及相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)，未見(jiàn)天麻中單糖和二糖類(lèi)成分含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。本研究擬建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLCELSD），同時(shí)檢測(cè)天麻中天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖4種指標(biāo)成分含量，并通過(guò)主成分分析（principal component analysis，PCA）及聚類(lèi)分析（cluster analysis，CA）比較不同產(chǎn)地、批次天麻藥材中的天麻素和糖類(lèi)成分差異，以期為天麻及相關(guān)功能食品的品質(zhì)、風(fēng)味評(píng)價(jià)方法提供參考。

1 材料與試劑

1.1 材料

無(wú)水葡萄糖（純度大于98%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；天麻素（純度大于98%）：山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；果糖、蔗糖（純度大于98%）：成都德思特生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：瑞典OCEANPAK化學(xué)公司。

天麻：收集于云南（YN）、貴州（GZ）、陜西（SX）和湖北（HB）4個(gè)產(chǎn)地，共25批，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)劉大會(huì)教授鑒定均為蘭科植物天麻的塊莖。樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 天麻藥材樣品信息Table 1 Sample information of Gastrodia elata Blume

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀、385蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：美國(guó)Agilent公司；SQP型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SB-5200DT超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；Direct-Q8UV-R純水制備水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

Capcell Pak NH2 UG80 S5色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B）：80%A-20%B，等度洗脫 25 min，流速 1.0 mL/min；柱溫為 25℃；ELSD檢測(cè)漂移管溫度為50℃；載氣為空氣，流速1.2 L/min；進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱(chēng)取天麻素10 mg、果糖10 mg、葡萄糖9 mg和蔗糖15 mg于10 mL容量瓶，分別加入10 mL 40%甲醇溶液配制成單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用于線(xiàn)性關(guān)系考察及定量限和檢測(cè)限分析。精密量取各單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，配制成天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖的質(zhì)量濃度分別為 0.005、0.2、0.18、0.6 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，用于各樣品中成分的含量測(cè)定。

1.3.2.2 供試品溶液

精密稱(chēng)取不同產(chǎn)地天麻樣品粉末約1.0 g，置磨口帶塞100 mL錐形瓶中，精密加入40%甲醇溶液50 mL，稱(chēng)重，超聲（功率240 W，頻率40 kHz）處理60 min，放冷至室溫（25℃）后，再次稱(chēng)量，用40%甲醇溶液補(bǔ)足重量，搖勻，吸取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，得濾液，精密吸取10 μL進(jìn)行HPLC分析。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密量取“1.3.2.1”項(xiàng)下單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，梯度稀釋配制成天麻素濃度為 0.01、0.016、0.032、0.064、0.08、0.1 mg/mL，果糖濃度為 0.02、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL，葡萄糖濃度為 0.018、0.09、0.18、0.36、0.72、0.9 mg/mL，蔗糖濃度為 0.12、0.24、0.48、0.96、1.2、1.5 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。

1.3.3.2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

在按照“1.3.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液、依照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析的條件下，精密稱(chēng)取天麻粉末約1.0 g，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，進(jìn)行精密度考察；精密稱(chēng)取天麻粉末約1.0 g，共6份，分別進(jìn)樣分析，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算樣品中天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖的含量，進(jìn)行重復(fù)性考察；精密稱(chēng)取天麻粉末約 1.0 g，置于室溫（25 ℃），分別在 0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣分析，并記錄各色譜峰峰面積，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

1.3.3.3 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的天麻約0.50 g，共6份，分別按已知含量的100%加入天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖對(duì)照品，按照“1.3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算各成分的加樣回收率。

1.3.3.4 定量限與檢測(cè)限考察

稀釋“1.3.2.1”項(xiàng)下單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，以S/N=10計(jì)算定量限（limit of quantitation，LOQ），以 S/N=3計(jì)算檢測(cè)限（limit of detection，LOD）。

1.4 提取溶劑的選擇

采用HPLC-ELSD測(cè)定不同濃度（20%、40%、60%、80%）甲醇溶劑下得到的樣品中天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。當(dāng)提取溶劑為20%和40%甲醇時(shí)，各待測(cè)成分含量較高，但差異并不明顯。綜合實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程，當(dāng)提取溶劑為20%甲醇時(shí)，天麻提取液成糊狀，需要多次離心和濾膜過(guò)濾得到澄清溶液，操作較為繁瑣，所以本試驗(yàn)選擇40%甲醇為提取溶劑。

1.5 含量測(cè)定與分析

分別取表1中25批不同產(chǎn)地的天麻樣品粉末約1.0 g，按照“1.3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算各成分含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

以天麻中天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖含量為變量，采用SPSS 21.0軟件對(duì)25批樣品中的4種成分進(jìn)行主成分分析（PCA）及聚類(lèi)分析（CA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

分別選取流動(dòng)相乙腈（A）-水（B）：90%A-10%B；80%A-20%B；60%A-40%B對(duì)樣品進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)采用80%A-20%B為流動(dòng)相，等度洗脫25 min，天麻樣品中天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖4種待測(cè)成分的色譜峰分離度較好，對(duì)照品及樣品的HPLC色譜圖如圖1所示。

圖1 混合對(duì)照品和樣品溶液的HPLC-ELSD色譜分析圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed control solution and sample solution

2.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

記錄“1.3.2.1”項(xiàng)下的系列單一標(biāo)準(zhǔn)溶液在“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定得到的峰面積，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得到目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和濃度與峰面積相關(guān)系數(shù)（R2）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 天麻中4種成分的回歸方程、線(xiàn)性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation，linear range and correlation coefficient of four components of gastrodia

由表2可知，天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖分別在質(zhì)量濃度 0.01mg/mL～0.10mg/mL、0.02mg/mL～1.00 mg/mL、0.018 mg/mL～0.900 mg/mL、0.12 mg/mL～1.50 mg/mL 內(nèi)線(xiàn)性范圍良好，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.999。

2.3 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)天麻樣品進(jìn)行精密度考察中，天麻素、果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD） 分別為 1.7%、1.5%、2.3%和 1.8%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好，符合試驗(yàn)要求。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖4個(gè)成分的含量的RSD分別為1.9%、1.7%、0.7%和1.8%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中測(cè)定得到的天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面積在24 h內(nèi)的RSD 分別為 2.7%、2.1%、2.7%和 1.8%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

對(duì)樣品進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)，結(jié)果顯示，天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖的平均加樣回收率分別為99.10%、99.10%、97.10%和 103.7%，RSD分別為 2.4%、1.9%、1.6%和1.3%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度較高。

2.5 定量限與檢測(cè)限

按照定量限和檢測(cè)限的測(cè)定方法，得到天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖的定量限分別為0.02、0.25、0.48、0.45 μg；檢測(cè)限分別為 0.005、0.08、0.15、0.15 μg。

2.6含量測(cè)定與分析

2.6.1 含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的天麻樣品進(jìn)行含量測(cè)定，其中天麻素、果糖、葡萄糖、蔗糖的含量測(cè)定結(jié)果具體見(jiàn)表3。

表3 25批天麻藥材中4種成分的含量測(cè)定Table 3 Determination of 4 components in 25 batches of gastrodia mg/g

由表3可知，4個(gè)產(chǎn)地25批天麻樣品中天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖的含量分別為0.86 mg/g～4.89 mg/g、0.97 mg/g～43.20 mg/g、1.34 mg/g～31.90 mg/g、13.62 mg/g～72.19 mg/g，含量差異較大，含量分布范圍較廣。圖2為各產(chǎn)地天麻中4種成分含量均值及同一產(chǎn)地中各成分的差異。分貴州產(chǎn)地天麻藥材的標(biāo)準(zhǔn)。湖北產(chǎn)區(qū)雖然未被明顯劃分為一類(lèi)，但是樣品聚集效果較好，表明湖北地區(qū)樣品質(zhì)量差距較小；陜西、云南兩地的樣品較為分散，說(shuō)明其樣品質(zhì)量差異較大。

圖2 同一產(chǎn)地間不同批次天麻中4種成分含量均值和差異分析Fig.2 Diagram of the average and difference of the contents of 4 components in different batches of gastrodia in the same production area

2.6.3 聚類(lèi)分析（CA）

采用SPSS21.0軟件，以天麻藥材的天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖的含量為變量，采用組間聯(lián)接方法對(duì)25批藥材進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同產(chǎn)地天麻藥材中4種成分含量聚類(lèi)圖Fig.4 Cluster diagram of 4 components content in gastrodia from different origins

由圖2可知，貴州產(chǎn)天麻中天麻素、果糖、葡萄糖及蔗糖的平均含量均較高，云南、湖北中蔗糖的平均含量次之，陜西產(chǎn)天麻中蔗糖平均含量最低；陜西、云南中果糖和葡萄糖的平均含量次之，湖北產(chǎn)天麻中果糖和葡萄糖含量最低；云南、湖北、陜西產(chǎn)天麻中天麻素含量無(wú)明顯差異。

2.6.2 主成分分析（PCA）

以天麻中天麻素、果糖、葡萄糖和蔗糖含量為變量，采用SPSS 21.0軟件對(duì)25批樣品進(jìn)行主成分分析，以主成分特征值大于1為提取原則，本試驗(yàn)提取了2個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為79.6%，說(shuō)明提取的2個(gè)主成分可以反應(yīng)主要成分的大部分信息，得到樣品主成分二維圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 25批天麻藥材主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis diagram of 25 batches of gastrodia

由圖3可知，貴州產(chǎn)地與其他3個(gè)產(chǎn)地相比被明顯區(qū)分，說(shuō)明本次研究測(cè)定的4種成分含量，可作為區(qū)

樣品間判別距離越小，說(shuō)明樣品相似度越高，當(dāng)判別條件距離為20時(shí)，25批天麻藥材被分為兩類(lèi)，貴州產(chǎn)地樣品（GZ-1～5）整體間距較小，說(shuō)明貴州產(chǎn)地整體相似度較高，與云南產(chǎn)地樣品（YN-2、YN-4）被分為一類(lèi)（Ⅱ），與上述PCA分析圖分布相一致；其余云南、湖北和陜西的18批藥材被分為另一類(lèi)（Ⅰ），其中湖北產(chǎn)地的 HB-3、HB-4、HB-6 與 HB-1、HB-2 間隔較小，說(shuō)明湖北產(chǎn)地樣品質(zhì)量差異較小；云南產(chǎn)地和陜西產(chǎn)地中都只有部分樣品相鄰，表明整體相似度較低，藥材成分含量分布不穩(wěn)定。綜合聚類(lèi)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚類(lèi)分布與主成分分析結(jié)果相互印證，說(shuō)明兩種分析分類(lèi)結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本研究建立了采用HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定天麻中天麻素、單糖（果糖和葡萄糖）和二糖（蔗糖）含量的方法，得到的ELSD色譜圖中，干擾峰較少，有利于目標(biāo)成分的含量測(cè)定，并且分析時(shí)間較短。采用建立的方法可簡(jiǎn)便高效的追蹤天麻在生長(zhǎng)、儲(chǔ)藏、炮制加工過(guò)程中，天麻素和糖類(lèi)物質(zhì)的含量變化，可為天麻及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和功能食品質(zhì)量控制提供更加全面參考依據(jù)。