雙水相系統提取槐米總黃酮的工藝研究

張愛珍，侯巧芝，霍柯柯

（1.河南地礦職業學院，河南鄭州451464；2.黃河科技學院醫學院，河南鄭州450063）

槐米是夏季槐花未開放時采摘的花蕾，其有效成分是黃酮類化合物——蘆丁（蕓香苷）。黃酮類化合物是一大類廣泛存在于植物中的化合物，具有保護心血管系統、抗菌及抗氧化等多種生物活性[1-3]。黃酮類化合物的主要提取方法有堿提酸沉法[4-5]、溶劑提取法[6-8]、水煎煮法[9]、微波輔助提取法[10-11]、超聲輔助提取法[12]、雙水相系統提取法[13]及超臨界提取法[14]等。黃酮類化合物常用的有機溶劑提取法提取時間比較長。雙水相系統提取法是利用高聚物-高聚物或高聚物-低分子鹽形成雙液體系，當兩種物質濃度達到臨界濃度時，該體系變為雙水相體系，被分離物在兩相中因具有分配差異而被提取。雙水相系統提取法具有技術簡單、分離速度快、易于純化、宜于放大進行工業化生產等優點，是天然產物活性成分提取的一種理想技術[15-18]。本文以槐米為研究對象，以聚乙二醇1000（polyethylene glycol 1000，PEG 1000）與硫酸銨雙水相系統為介質，超聲輔助提取槐米中的總黃酮，利用可見分光光度法對槐米中的總黃酮含量進行測定，探究最佳的提取工藝，以期為黃酮類化合物的工業化開發的研究提供一定的方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槐米：市售。將槐米放于恒溫50℃的烘箱干燥2 h，粉碎過80目篩后裝瓶備用。

聚乙二醇1000（化學純）：國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銨、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉（以上均為分析純）：鄭州派尼化學試劑廠；蕓香苷水合物標準品（優級純）：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器設備

可見分光光度計（7230G）：上海菁華科技儀器有限公司；高速中藥粉碎機（XFB-200）：吉首市中誠制藥機械廠；超聲波清洗器（KQ-300V型）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雙水相體系的選擇

配制40%的PEG 1000和40%的硫酸銨溶液。取配制好的兩種溶液，按照PEG 1000溶液和硫酸銨溶液體積比分別為 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混合，總體積均為10mL，置于離心管中，搖勻，靜置1h，觀察分層情況并分別記錄上下相體積之比。

1.3.2 總黃酮標準曲線的繪制

以蕓香苷為標準品，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[19]檢測總黃酮含量。稱取10mg蕓香苷水合物，加水溶解后轉移至100 mL容量瓶中定容，搖勻，得0.1 mg/mL的蕓香苷水合物標準溶液。用移液管分別吸取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL 的蕓香苷標準溶液于 50 mL的容量瓶中，加入蒸餾水約至25 mL，然后依次加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，再加入4%的氫氧化鈉溶液2 mL及60%的乙醇溶液10 mL，最后用蒸餾水定容，搖勻靜置25 min。不加槐米的作為空白對照組。在510 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

1.3.3 槐米中總黃酮的分離提取

稱取槐米粉末 1 g，按料液比 1∶40（g/mL）溶解于40 mL雙水相系統中，在30℃下超聲30 min，抽濾，將濾液倒入離心管中，靜置10 min，記錄上下相的體積之比。分別取上下相各1 mL于50 mL容量瓶中，加入適量的蒸餾水稀釋，按1.3.2的比色法測定吸光度，然后計算總黃酮的含量。

1.3.4 槐米中總黃酮萃取率和得率的測定和計算[20]

Y/%=RK/（1+RK）×100，R=V上/V下，K=A上/A下

式中：R為上下相的體積比，V上、V下分別為上、下相體積，mL；K為總黃酮在兩相中的分配系數，A上、A下分別為上、下相吸光度，Y為萃取率。

式中：Y'為總黃酮得率，mg/g；C為總黃酮質量濃度，由標準曲線計算得到，mg/mL，V為待測液的體積，mL；D為稀釋倍數；m為槐米粉末的質量，g。

1.3.5 單因素試驗

固定其他條件，改變其中的一個條件，分別考察PEG 1000質量分數（20%、22%、24%、26%、28%、30%、32%）、料液比 [1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]、浸提溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）、硫酸銨質量分數（10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%）4個因素對總黃酮萃取率的影響。

1.3.6 正交試驗

在單因素試驗基礎上，設計四因素三水平正交試驗，確定槐米總黃酮提取的最優工藝。

2 結果與分析

2.1 雙水相系統中PEG 1000溶液與硫酸銨溶液不同體積比時的分相結果

雙水相系統中PEG 1000溶液與硫酸銨溶液不同體積比的分相結果見表1。

表1 雙水相系統中PEG 1000與硫酸銨溶液不同體積比的分相結果Table 1 Volume ratio of aqueous two-phase system mixed by polyethylene glycol 1000 solution and ammonium sulfate solution

從表1中可以看出，在PEG1000溶液和硫酸銨溶液體積比為6∶4時，雙水相系統中上下相體積差最小，因此試驗選用PEG1000溶液和硫酸銨溶液6∶4的體積比。

2.2 總黃酮標準曲線的繪制

以吸光度A對濃度C（mg/mL）作圖，得到蕓香苷水合物的標準曲線見圖1。

圖1 蕓香苷水合物標準曲線Fig.1 Absorbance-concentration standard curve of rutin hydrate

回歸方程為y=14.19x-0.000 3，相關系數R為0.999 8，表明吸光度與濃度在0～0.05 mg/mL范圍內有良好的線性關系。

2.3 單因素影響結果

2.3.1 PEG 1000質量分數對槐米總黃酮萃取的影響

PEG 1000質量分數對槐米總黃酮萃取率的影響見圖2。

圖2 PEG 1000質量分數對槐米總黃酮萃取率的影響Fig.2 Effect of PEG 1000 mass fraction on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可以看出，當PEG 1000質量分數逐漸增加時，槐米總黃酮的萃取率先增加后降低。在PEG 1000質量分數為26%時，總黃酮的萃取率最大。因此，在正交試驗時，選取PEG 1000質量分數分別為24%、26%和28%。

2.3.2 料液比對槐米總黃酮萃取的影響

料液比對槐米總黃酮萃取率的影響見圖3。

圖3 料液比對槐米總黃酮萃取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可以看出，隨著液體體積逐漸增加，槐米總黃酮的萃取率呈增加趨勢，總黃酮的萃取率在料液比1∶60（g/mL）時最大，然后減小。結合試驗，正交試驗選擇料液比分別為 1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）。

2.3.3 浸提溫度對槐米總黃酮萃取率的影響

浸提溫度對槐米總黃酮萃取率的影響見圖4。

圖4 浸提溫度對槐米總黃酮萃取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，當浸提溫度不斷升高時，槐米總黃酮的萃取率先增加后降低。在50℃時達最大值，之后隨著浸提溫度的升高逐漸減小。結合試驗和經濟成本因素，正交試驗選取浸提溫度為40、50、60℃。

2.3.4 硫酸銨質量分數對槐米總黃酮萃取率的影響

硫酸銨質量分數對槐米總黃酮萃取率的影響見圖5。

圖5 硫酸銨質量分數對槐米總黃酮萃取率的影響Fig.5 Effect of ammonium sulfate mass fraction on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，在硫酸銨質量分數為10%時，總黃酮的萃取率最大，隨著硫酸銨質量分數的增大，總黃酮的萃取率變小。結合試驗，選取正交試驗的硫酸銨質量分數分別為10%、12%和14%。

2.4 正交試驗

根據單因素試驗所得數據，選取PEG 1000質量分數、料液比、浸提溫度、硫酸銨質量分數4個因素，通過正交試驗研究了萃取最佳條件。因素水平見表2，正交試驗結果分析及方差分析見表3、表4。

表2 正交試驗因素水平Table 2 Orthogonal experiment factors and levels of the flavonoids

表3 正交試驗結果分析Table3 Orthogonal experiment results and analysis of the flavonoids

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance of the orthogonal array design

由表4可知，正交試驗的各因素對提取率的影響均不顯著。綜合表3和表4可以得出影響總黃酮萃取率的主次順序為D＞C＞A＞B，即硫酸銨質量分數對槐米總黃酮萃取率的影響最大，其次為浸提溫度，PEG 1000質量分數對總黃酮萃取率的影響最小。從正交試驗結果分析可得出提取總黃酮最優工藝條件為A3B2C1D1，即 PEG 1000 質量分數為 28%，料液比 1∶60（g/mL），浸提溫度40℃，硫酸銨質量分數為10%。

2.5 驗證性試驗

在 PEG1000 質量分數為 28%，料液比 1∶60（g/mL），浸提溫度40℃，硫酸銨質量分數10%，超聲時間30 min的條件下，進行了3次平行試驗，萃取3次，總黃酮的平均萃取率為95.91%，得率為20.53 mg/g，相對標準偏差為0.248 7%，結果重現性好。

3 結論

本研究采用單因素試驗及正交試驗得到了雙水相系統萃取槐米總黃酮的最優工藝為PEG 1000質量分數 28%，料液比為 1∶60（g/mL），浸提溫度 40 ℃，硫酸銨質量分數為10%。在該條件下，進行3次平行試驗，總黃酮的萃取率為95.91%，得率為20.53 mg/g。結果重現性好，工藝穩定可行。該提取方法可為槐米總黃酮的工業化開發的研究提供一定的方法參考。