秋葵黃酮的超聲輔助循環(huán)提取工藝及其穩(wěn)定性的研究

周婧琦，高愿軍，秦令祥，崔勝文

（1.漯河食品職業(yè)學院，河南漯河462300；2.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南鄭州450002；3.漯河市食品研究院有限公司，河南漯河462300）

秋葵（Okra）又稱咖啡黃葵、羊角豆[1]，屬錦葵科、秋葵屬草本植物[2]，含有豐富的營養(yǎng)成分，例如多糖、黃酮、氨基酸、礦物質(zhì)等，有“綠色人參”之稱[3-4]，可降血脂、增強免疫力、抗氧化、降血糖、抗癌、抗炎、防衰老等[5-11]。秋葵黃酮是秋葵中含有的一種重要的功效成分，其可抗氧化、抑菌、防腫瘤、抗病毒等[12-13]，被廣泛用于食品、保健食品、醫(yī)藥和化妝品等領域，具有很好的應用價值和前景。

超聲輔助循環(huán)提取是目前功能性成分提取較為先進的和最具發(fā)展前景的技術，該技術一是利用超聲波的“空化作用”和“高頻機械振動”，促進功效成分向溶劑的擴散和溶出，提高功效成分的溶出率，縮短提取時間；二是利用超聲場作用于循環(huán)流動狀態(tài)的物料的均勻性，提高物料提取處理量。該技術具有高效、低溫、快速、提取率高等優(yōu)點[14-17]。本文以超聲輔助循環(huán)提取秋葵黃酮，并對其提取工藝進行優(yōu)化；同時對其穩(wěn)定性進行研究，為秋葵黃酮的提取與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋葵：市售；NaOH、HCl、蔗糖、檸檬酸、偏重亞硫酸鈉、山梨酸鉀、抗壞血酸、無水乙醇、葡萄糖等（均為分析純）：天津德恩化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CTXW-2B超聲循環(huán)提取機：北京弘祥隆生物技術開發(fā)有限公司；PHS-3E pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；DK-98-ⅡA水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發(fā)儀：濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；FC-18A真空冷凍干燥機：河北國輝實驗儀器有限公司；CWF-A中藥粉碎機：長沙萬德機械設備有限公司；EYG-3004實驗室超聲波清洗機：北京宇翔超聲工業(yè)設備有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機：愛來寶（濟南）醫(yī)療科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

選取完好、無損、無蟲蛀的鮮秋葵，切成2 mm薄片，真空冷凍干燥24 h，用中藥粉碎機粉碎，過100目篩，備用。

1.3.2 秋葵黃酮的提取方法

秋葵干粉→乙醇溶液→超聲輔助循環(huán)提取[18]→提取液離心（6 000 r/min，15 min）→上清液濃縮（旋轉蒸發(fā)儀）→秋葵黃酮浸膏→真空冷凍干燥→粉碎→秋葵黃酮粉末→AB-8大孔樹脂純化[19]→濃縮→冷凍干燥→純化后的秋葵黃酮粉

1.3.3 秋葵黃酮目標波長的確定

將純化后的秋葵黃酮粉溶于70%乙醇溶液中，制成濃度為20 μg/mL的溶液。然后，用紫外可見分光光度計掃描其光譜，波長設置在200 nm～400 nm，獲取最大吸收波長。

1.3.4 秋葵黃酮的測定

采用李加興等[8]的方法，根據(jù)蘆丁標準曲線和回歸方程計算秋葵黃酮的含量。

1.3.5 秋葵黃酮得率的計算

秋葵黃酮得率/%=（提取液中的黃酮含量/秋葵干粉質(zhì)量）×100

1.3.6 超聲循環(huán)技術提取秋葵黃酮的試驗設計

1.3.6.1 超聲輔助循環(huán)提取秋葵黃酮的單因素試驗設計

稱取10g秋葵干粉5份，按1.3.2的方法，進行超聲輔助循環(huán)提取，考察各因素的影響。本試驗采用體積分數(shù)70%的乙醇溶液，固定旋轉速度為800 r/min，超聲間歇比為 1∶3，料液比 1∶25（g/mL），提取時間 40 min，提取溫度50℃，超聲波功率400 W進行試驗。分別設定料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 和 1∶30（g/mL），提取時間為 30、35、40、45 和 50min，提取溫度為 35、40、45、50和55℃，超聲功率為100、200、300、400和500 W，進行單因素試驗，每個試驗重復3次。

1.3.6.2 超聲輔助循環(huán)提取秋葵黃酮的正交試驗設計因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factor levels table of orthogonal experimental design

1.3.7 秋葵黃酮的穩(wěn)定性試驗設計

設置不同的溫度、pH值和金屬離子等條件，測量最大波長處吸光度的變化，并掃描曲線，觀察不同條件對其影響。

1.3.7.1 溫度對秋葵黃酮穩(wěn)定性的影響

取具塞試管10個，各加入含量為20 μg/mL的秋葵黃酮待測液 4mL，分別置于0℃冰浴和 10、20、30、40、50、60、70、80、90℃水浴下保溫1h，然后放置到自然室溫25℃，并對不同溫度的樣液分別掃描200 nm～400 nm下的光譜曲線，測260 nm和350 nm下的吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.7.2 pH值對秋葵黃酮穩(wěn)定性的影響

用HCl和NaOH制成pH1～13的溶液，各加入秋葵黃酮粉末，至其濃度為20 μg/mL，靜置1 h，然后對不同pH值的樣液分別掃描200 nm～400 nm下的光譜曲線，測260 nm和350 nm下的吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.7.3 金屬離子對秋葵黃酮穩(wěn)定性的影響

在秋葵黃酮溶液中（秋葵黃酮濃度20 μg/mL）各添加 0.02%～0.1%的 Na+、K+、Ca2+、Fe3+、Cu2+等 5 種金屬離子，搖勻后靜置1 h，并對加入不同離子的樣液分別掃描200 nm～400 nm下的光譜曲線，測260 nm和350 nm下的吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和正交設計助手ⅡV3.1軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助循環(huán)提取秋葵黃酮工藝條件優(yōu)化

2.1.1 料液比對秋葵黃酮得率的影響

料液比對秋葵黃酮得率的影響見圖1。

圖1 料液比對黃酮得率影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

由圖1可知，黃酮得率隨著溶劑量的增大不斷升高后趨于穩(wěn)定。這是因為溶劑量的增大，秋葵黃酮與溶劑間的有效成分濃度差增大，增加了擴散推動力，黃酮得率升高。但當料液比超過1∶25（g/mL）后，溶劑再繼續(xù)增多，得率也不會明顯升高，而趨于平緩。因此，選取料液比1∶25（g/mL）進行后續(xù)試驗。

2.1.2 提取時間對秋葵黃酮得率的影響

提取時間對秋葵黃酮得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

由圖2可知，黃酮得率隨著提取時間的延長先升高再降低。這是因為，提取時間過短，超聲波的作用不完全，黃酮溶出少，得率較低；提取時間過長，超聲波作用時間也過長，黃酮穩(wěn)定性變差，會發(fā)生部分分解，得率降低。因此，選取提取時間40 min進行后續(xù)試驗。

2.1.3 提取溫度對秋葵黃酮得率的影響

提取溫度對秋葵黃酮得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

由圖3可知，黃酮得率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這是因為，升高提取溫度，擴散系數(shù)增大，功效成分溶出速度加快，得率升高；但是溫度過高，秋葵黃酮的結構會被部分破壞，導致得率降低。因此，選取提取溫度50℃進行后續(xù)試驗。

2.1.4 超聲功率對秋葵黃酮得率的影響

超聲功率對秋葵黃酮得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of flavonoids

由圖4可知，在超聲功率100 W～400 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增加，黃酮得率不斷升高，但當超聲功率超過400 W后，黃酮得率會略有下降。這是因為，增加超聲功率，其空化和機械作用加強，秋葵細胞壁破壞增多，黃酮溶出增多，得率升高；但超聲功率超過400 W后，黃酮溶出基本溶出完全，再繼續(xù)增加超聲功率，超聲波會對黃酮結構造成部分破壞，導致得率略有下降。因此，選取超聲功率400 W進行后續(xù)試驗。

2.1.5 超聲輔助循環(huán)提取秋葵黃酮的正交試驗結果

超聲輔助循環(huán)提取秋葵黃酮正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

由表2、表3分析可知，各因素影響關系為：D＞A＞B＞C，最優(yōu)組合為D2A2B3C3。超聲功率和料液比對黃酮得率的影響較大，達到顯著水平，其它不顯著。最佳工藝參數(shù)為：超聲功率 400 W，料液比 1∶25（g/mL），提取時間45 min，提取溫度55℃。在最佳條件下做驗證試驗，平行驗證3次，秋葵黃酮平均得率為4.62%。

表2 正交試驗結果Table 2 The result of orthogonal experimental design

表3 方差分析結果Table 3 The variance analysis results

2.2 秋葵黃酮穩(wěn)定性的影響

2.2.1 秋葵黃酮光譜特性與目標波長的測定秋葵黃酮的紫外光譜見圖5。

圖5 秋葵黃酮的紫外光譜吸收曲線Fig.5 The UV absorption curve of okra flavonoids

由圖5可知，在240 nm～280 nm和290 nm～380 nm兩個波長區(qū)域，秋葵黃酮有兩個吸收帶，這與黃酮類化合物的基本特征相一致。其中240nm～280nm區(qū)域的吸收帶為Ⅱ帶，290nm～380nm區(qū)域的吸收帶為Ⅰ帶，其中兩個吸收帶的最大吸收波長分別為350 nm和260 nm，因此，選取這兩個波長的吸光度來研究其穩(wěn)定性。

2.2.2 溫度對秋葵黃酮穩(wěn)定性的影響

溫度對秋葵黃酮待測液吸光度的影響見表4。

表4 溫度對秋葵黃酮待測液吸光值的影響Table 4 Influence of temperature on absorbancy of okra flavonoids

由表4可以看出，采取SPSS17.0對獲取的數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗，結果表明，在0℃～40℃下，秋葵黃酮保溫1 h，其吸光度變化不明顯，穩(wěn)定性好，50℃以上吸光度變化明顯，因此，判斷秋葵黃酮低于50℃溫度下保溫1 h，結構無改變，吸光度略微增加的原因可能是溶劑的輕微蒸發(fā)造成的，但溫度越高吸光度變化越明顯，90℃時吸光度變化最明顯，說明結構有發(fā)生改變趨勢，因此，在50℃以下加工為宜。

2.2.3 pH值對秋葵黃酮穩(wěn)定性的影響

不同pH值對秋葵黃酮待測液吸光度的影響見表5。

表5 不同pH值對秋葵黃酮待測液吸光值的影響Table 5 Influence of pH on absorbancy of okra flavonoids

由表5可知，與對照組相比，在酸性環(huán)境下，秋葵黃酮在260 nm和350 nm處吸光度沒有變化，表明其結構在酸性條件下不改變；但是，用中性試劑制備的黃酮樣液在350 nm處，吸光度變化顯著，且隨著溶劑pH值的增加，在260 nm和350 nm處的吸光度變化都極顯著，表明秋葵黃酮結構在堿性條件下易被破壞，在酸性條件下穩(wěn)定性良好。因此，秋葵黃酮應在弱酸性條件下儲存為宜。

2.2.4 金屬離子對秋葵黃酮穩(wěn)定性的影響

金屬離子對秋葵黃酮待測液吸光度的影響見表6和表7。

由表 6和表 7可知，當 Na+、K+、Ca2+濃度低于0.08%時，秋葵黃酮在260 nm和350 nm處的吸光度沒有顯著影響，表明秋葵黃酮在Na+、K+、Ca2+濃度低于0.08%時，其結構不發(fā)生變化，穩(wěn)定性較好；而當溶劑中有Fe3+、Cu2+離子時，各離子濃度的秋葵黃酮在260 nm和350 nm處的吸光度均明顯變小，表明其結構發(fā)生改變。因此，在加工秋葵黃酮時，應避免與Fe3+、Cu2+離子接觸。

表6 金屬離子Na+、K+和Ca2+對秋葵黃酮待測液吸光度的影響Table 6 Influence of metal ion Na+，K+and Ca2+on absorbancy of okra flavonoids

表7 金屬離子Fe3+和Cu2+對秋葵黃酮待測液吸光度的影響Table 7 Influence of metal ion Fe3+and Cu2+on absorbancy of okra flavonoids

3 結論

本試驗采用超聲輔助循環(huán)提取秋葵黃酮，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為：超聲功率 400 W，料液比 1∶25（g/mL），提取時間45 min，提取溫度55℃，該條件下，秋葵黃酮得率為4.62%。同時對秋葵黃酮穩(wěn)定性的影響進行了研究，結果表明：秋葵黃酮溶液具有較好的耐熱性，其化學結構在50℃以下保持不變；在酸性條件下，秋葵黃酮穩(wěn)定性良好；當金屬離子Na+、K+、Ca2+濃度低于0.08%時，對秋葵黃酮的穩(wěn)定性無顯著影響，而Fe3+、Cu2+對其穩(wěn)定性有顯著影響。本試驗可為秋葵黃酮的深加工提供一定參考。