低亞硝酸鹽型中式發酵香腸的研制

張靜，王淑培，李炎芳，3，張蕾

（1.武夷學院茶與食品學院，福建武夷山354300；2.南寧師范大學環境與生命科學學院，廣西南寧530001；3.維正知識產權科技有限公司，福建泉州362000；4.河北安普檢測技術服務有限公司，河北邢臺055550）

發酵香腸又稱生香腸，是發酵肉制品的典型代表，是指以豬肉或牛肉為主要原料，絞碎后同鹽、糖、發酵劑和香辛料等混合后灌進腸衣，經過微生物發酵而制成的具有穩定的微生物特性和典型的發酵香味的肉制品[1-3]。目前，國內外在發酵香腸的生產中常加入硝酸鹽和亞硝酸鹽作為發色劑[4]，使產品呈現誘人的玫瑰紅色，抑制微生物繁殖，尤其對肉毒梭狀芽孢桿菌抑制效果明顯，從而延長儲存期，并能賦予產品特殊風味[5]。但過量攝入亞硝酸鹽使人體血液的載氧能力下降，從而導致機體組織缺氧。此外，亞硝酸鹽可與食物或胃中的次級胺（仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸）結合形成亞硝胺從而誘發消化系統癌癥[6-7]。我國對中式香腸和火腿腸中亞硝酸鹽限量制定嚴格的標準，GB/T 23493—2009《中式香腸》中規定臘腸、風干腸亞硝酸鹽含量不高于30mg/kg，GB/T20712—2006《火腿腸》中規定肉制品、火腿腸、灌腸類亞硝酸鹽含量不高于30mg/kg。

亞硝酸鹽在肉制品加工中具有獨特作用，但到目前為止，研究人員仍在對能夠完全替代亞硝酸鹽的物質進行探討。研究發現，采用發色劑（紅曲色素、甜菜紅、番茄紅素、蛋黃粉、抗壞血酸、氨基酸等）和抑菌劑（乳酸菌、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀等）部分替亞硝酸鹽是降低肉制品中亞硝酸鹽含量并能保證制品品質的有效途徑[8-9]。

紅曲，也稱紅曲米，是我國的傳統發酵產品，是紅曲霉接種在大米經發酵而成的產品，長期應用于食品著色防腐及藥物加工。紅曲霉能產生豐富的水解酶、酸、醇、酯類等一級代謝物質，可賦予發酵食品優良的香氣與獨特的味道。紅曲霉的次級代謝產物——紅曲色素，可用于代替亞硝酸鹽添加于肉制品中。紅曲色素是一種天然色素，具有對pH值穩定、受熱穩定、理化性質穩定（不受金屬離子、氧化劑、還原劑的影響）、有較強蛋白質著色能力以及具有一定的抑菌作用等特性[10-12]。已經有較多的研究單獨使用紅曲粉或者紅曲色素應用于發酵肉制品中[13-17]，本試驗綜合利用紅曲米及紅曲色素替代部分亞硝酸鈉進行發酵香腸的研制，并對關鍵發酵工藝參數條件進行優化，以期生產出適口性好、品質優良的發酵香腸，為進一步的工業化開發提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、食鹽、葡萄糖、蔗糖、香辛料：市售；肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、漢遜德巴利酵母菌（Debaryomyces hansenii）：上海嘉楚生物工程有限公司；紅曲粉：古田縣帝源紅曲廠；亞硝酸鈉（食品級）：四川金山制藥有限公司；紅曲色素、異抗壞血酸鈉（食品級）：廣東科隆生物科技有限公司。無水乙醚、NaOH、NaCl、無水葡萄糖（分析純）：上海展云化工有限公司。月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose，LST）肉湯、平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基：廣東環凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計（UV-3200S）：上海美普達儀器有限公司；測色色差儀（WSC-S）：上海精密科學儀器有限公司；電子天平（TE124S）：賽多利斯科學儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-50S11）：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9245A）：上海慧泰儀器制造有限公司；恒溫培養箱（BKB11-II）：濟南語駐醫療有限公司；料理機（JYLC022E）：九陽股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵香腸的制作

1.3.1.1 基本配方

參照鞏洋等[18]的配方并進行了調整，豬瘦肉700 g，豬脂肪300 g，食鹽20 g，葡萄糖5 g，蔗糖5 g，異抗壞血酸鈉0.4 g，香辛料10 g，復合發酵劑（木葡萄球菌、清酒乳桿菌、漢遜德巴利酵母菌）107CFU/g，亞硝酸鈉40mg，紅曲粉 1.5 g，紅曲色素 40 mg。

1.3.1.2 發酵香腸的生產工藝流程

原料肉修整→制餡→攪拌（加入輔料及發酵劑）→灌腸→發酵→干燥成熟（低溫）→檢驗→包裝

1.3.1.3 發酵香腸的操作要點

1）預處理：選料，一般選用新鮮、無污物、色澤鮮紅的豬前腿肉。去皮除筋后用清水多次沖洗，直至表面沒有血漬、污物。

2）制餡：用絞肉機將瘦肉打成肉糜，脂肪切成3cm左右的方丁，放入冰箱冷卻至4℃以保證肉餡的制備效果。

3）攪拌：將冷卻好的瘦肉和脂肪以7∶3（質量比）的比例在盆中攪拌混勻，加入香辛料、腌制劑、發酵劑等輔料再次進行攪拌，至混料均勻，肉溫不能過高。

4）灌腸：用清水將腸衣表面食鹽清洗干凈，置于溫水中浸泡，換水數次以保證腸衣內外食鹽已徹底洗凈，也可潤滑腸衣內壁，有助于灌腸。將處理好的腸衣套在灌腸器漏斗上，在最前端用細繩系口，開始往腸衣中灌餡。灌腸要求腸體緊密飽滿，避免產生氣泡，如有氣泡產生，要用牙簽刺破腸衣將氣體排出，避免影響發酵香腸的感官品質及貨架期。

5）發酵：將灌裝好的香腸掛置在溫度22℃，相對濕度（relative humidity，RH）為85%～90%的恒溫恒濕培養箱中發酵，至香腸的pH值降至4.5～5.5，發酵約60 h。如果發酵過程中，由于發酵條件不當，腸體表面受到微生物污染，可采用濃度10%以上的鹽水清洗。

6）干燥成熟：將發酵完成的香腸掛在溫度為13℃，相對濕度為90%，空氣流速為0.1 m/s，濕度每日下降5%恒溫恒濕培養箱干燥成熟2周。

1.3.2 試驗指標的測定方法

1.3.2.1 亞硝酸鹽殘留量

亞硝酸鹽殘留量按照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的方法，采用鹽酸萘乙二胺法進行測定，亞硝酸鹽殘留量的單位為mg/kg。

1.3.2.2 紅度值

參考王中帥[19]的方法，用WSC-S型測色色差儀測定紅度值，重復測定4次，取平均值。

1.3.2.3 pH值

pH值按照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》中的方法進行測定。

1.3.2.4 綜合感官評價方法

將試驗所得到的產品放在白色盤子中，隨機編號，由20名受過感官品評訓練的食品專業的學生組成感官評價小組，按照色澤、組織形態、質地、風味順序，逐一對發酵香腸進行感官評定。參照GB/T 23493—2009《食品安全國家標準中式香腸》及上海市地方標準DB 31/2004—2012《食品安全地方標準發酵肉制品》中感官指標要求，結合發酵香腸自身特點，制定發酵香腸感官評價標準，見表1，滿分20分，所得分數平均值作為感官評分。

表1 發酵香腸感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of fermented sausage

1.3.3 試驗設計

1.3.3.1 單因素試驗

按照發酵香腸生產工藝的要求，分別對影響低亞硝酸鹽型發酵香腸的感官品質起關鍵作用的亞硝酸鈉的添加量、復合發酵劑的體積比、紅曲色素的添加量、紅曲粉添加量、發酵時間這5個因素進行研究，設計單因素試驗，以發酵香腸的亞硝酸鹽殘留量、紅度值、pH值和綜合感官評分作為品質的評價標準，確定各個單因素對發酵香腸品質的影響。

固定亞硝酸鈉添加量40 mg、紅曲粉1.5 g、紅曲色素 40 mg、復合發酵劑體積比 1∶1∶1（均為 107CFU/g，接種量為 0.01 mL/g），發酵時間設置 24、36、48、60、72 h 5個梯度，對發酵時間進行優化。

固定亞硝酸鈉添加量40mg、紅曲粉1.5g、紅曲色素40 mg，發酵時間48 h，復合發酵劑中清酒乳桿菌、肉葡萄球菌、漢遜德巴利酵母菌的體積比為 5∶1∶1、5∶1∶2、5∶2∶1、6∶1∶1、4∶1∶1，在這 5 個梯度下對復合發酵劑的體積比進行優化。

固定紅曲粉添加量1.5 g、紅曲色素40 mg，復合發酵劑體積比為4∶1∶1，發酵時間48 h，設置亞硝酸鈉添加量 10、20、30、40、50 mg 5 個梯度，對亞硝酸鈉的添加量進行優化。

固定亞硝酸鈉添加量30 mg，紅曲色素40 mg，復合發酵劑體積比為4∶1∶1，發酵時間48 h，設置紅曲粉添加量 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g 5 個梯度，對紅曲粉的添加量進行優化。

固定亞硝酸鈉添加量30 mg，紅曲粉1.5 g，復合發酵劑體積比為4∶1∶1，發酵時間48 h，設置紅曲色素添加量 20、30、40、50、60 mg 5 個梯度，對紅曲色素添加量進行優化。

1.3.3.2 正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上設計正交試驗，選取亞硝酸鈉添加量、紅曲粉添加量、紅曲色素添加量和復合發酵劑體積比4個試驗因素進行四因素三水平的正交試驗，以感官品質為指標，確定低亞硝酸鹽型發酵香腸的最佳配方。正交試驗設計因素水平表見表2。

表2 低亞硝酸鹽型發酵香腸配方正交設計因素水平設計Table 2 The factors and levels of orthogonal design of fermented sausage with low-nitrite

1.4 數據處理與分析

運用Excel 2019統計所有數據，數據分析采用SPSS 20軟件。方差分析采用ANOVA分析，采用Duncan’s多重比較進行差異顯著性分析。圖表繪制采用Origin 9.0軟件。正交試驗設計及分析使用Minitab 16。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵時間對香腸品質的影響

發酵時間對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響見圖1。

圖1 發酵時間對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on pH value，redness，sensory quality and nitrite residue of sausage

由圖1可知，發酵時間對產品的色澤、pH值、感官評分及亞硝酸鹽殘留量均有較大影響。加入發酵劑后，產品的pH值開始明顯下降，至發酵48 h時，降至最低值，為5.14，此時香腸口感較酸，適口性較差；隨后又緩慢上升。pH值在發酵前期的下降是由于發酵劑的生長繁殖產酸所致，后期的回升可能與蛋白質酶水解所產生的堿性物質（如堿性的游離氨基酸、肽、和胺類）的積累有關[20-21]。當發酵至36 h時，產品的亞硝酸鹽殘留量最低，為（0.034±0.002）mg/kg，隨后呈現波動上升的趨勢。當發酵時間為60 h時，產品的感官品質評分最高，發酵香腸呈玫瑰紅色，質地緊致，肥肉切片透明均勻，香味濃郁，口感良好，亞硝酸鹽殘留量都較理想。繼續發酵至72 h時，香腸風味變化，感官評分減低，且亞硝酸殘留量增高。故發酵時間以60 h為宜。

2.1.2 復合發酵劑體積比對產品品質的影響

相對于自然發酵，添加適宜的發酵劑可以顯著縮短發酵周期，控制發酵過程，提高發酵的安全性，降低致病和腐敗細菌的風險，保持穩定性和保質期，提高產品的營養及感官品質，也是實現規模化生產的保障[22-23]。發酵肉制品中常用的發酵劑包括乳酸菌、酵母菌、微球菌、葡萄球菌屬、霉菌等[24]。在香腸發酵過程中，乳酸菌起主導作用。乳酸菌可以發酵碳水化合物產生乳酸、乙酸等，降低產品的pH值，同時促進蛋白質的凝膠化進程，加快香腸的干燥速度，促進產品發色，降低生物胺含量等。葡萄球菌和微球菌被稱為是發酵香腸生產中的“呈香菌”，同時也提高色澤穩定性，對發酵香腸良好風味和感官品質的形成具有重要的作用[25-27]。酵母可以消耗腸內氧氣，減少脂質氧化，降低氧化還原電勢，從而抑制肉制品因氧化而產生的變色，并穩定定殖在香腸表面，成膜分布，防止產品過度脫水；同時酵母水解脂肪和蛋白質產生酯類、酮類、醇類等物質，有利于發酵肉制品風味形成。通常采用混合發酵劑的產品風味更佳。

前期菌種篩選試驗發現，清酒乳桿菌、肉葡萄球菌、漢遜德巴利酵母菌3種菌種能顯著提高發酵香腸的風味。進一步通過發酵劑的復配，改善發酵工藝，復合發酵劑體積比對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響見圖2。

由圖2可知，3種發酵劑的體積比對產品pH值、亞硝酸鹽殘留量及感官品質均有較大的影響。當3種發酵劑的體積比為5∶2∶1時，肉葡萄球菌的添加量較高，產品有微弱的不良氣味，可能與肉葡萄球菌量過高引起的脂類氧化及氨基酸代謝旺盛，致使不良氣味的小分子物質（如戊醛、庚醛等）濃度較高引起的[28]，此時樣品的pH值和亞硝酸鹽殘留量均較高。當3種發酵劑的體積比為4∶1∶1時，產品中的亞硝酸鹽含量最低，肉質pH值為5.08，較為理想，且肉質均勻，感官評分最高，因此，選擇混合發酵劑的體積比為4∶1∶1。

圖2 復合發酵劑體積比對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.2 Effect of compound starter volume ratio on the pH value，redness，sensory quality and nitrite residue of sausage

2.1.3 亞硝酸鈉添加量對產品品質的影響

亞硝酸鹽在發酵香腸中具有改善肉品色澤、抑菌防腐、豐富產品風味、抑制脂肪氧化等作用[29]。亞硝酸鹽帶來的危害也備受消費者關注。但迄今為止還未能找到一種物質在腌肉制品中完全替代亞硝酸鹽[4]。因此，減少肉制品中亞硝鹽的添加量是降低安全風險的重要措施。亞硝酸鈉添加量對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響見圖3。

圖3 亞硝酸鈉添加量對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.3 Effects of sodium nitrite addition on pH value，redness，sensory quality and nitrite residue of sausage

從圖3中可以看出，隨著亞硝酸鈉的增加，香腸產品中亞硝酸鹽殘留量逐漸上升，在添加量為50 mg時亞硝酸鹽殘留量達到最大，為0.039 mg/kg，遠遠低于我國發酵肉制品中＜30 mg/kg的標準。當添加量為10 mg和20 mg時，香腸表面及瘦肉呈粉紅色，肥肉偏黃，發酵風味欠佳。當添加量為30 mg時，在紅曲色素及紅曲粉的協同增色作用下，香腸表面及瘦肉呈玫瑰紅色，產品感官評分最好，產品質地及風味均較佳，故選定亞硝酸鈉最適添加量為30 mg。

2.1.4 紅曲粉添加量對產品品質的影響

紅曲粉中包含了紅曲霉以及菌種的菌體外水解酶、酸、醇、酯類等一級代謝物質，可賦予發酵食品優良的香氣與甘甜的味道，其次級代謝產物紅曲色素，可用于代替部分亞硝酸鹽添加于肉制品中，賦予肉制品誘人的色澤[20]。適量添加紅曲粉能有效改善并穩定發酵香腸的色澤，延長保質期，且不干擾香腸的風味和質地[30-31]。試驗通過添加紅曲粉，改善減少亞硝酸鈉用量帶來的色澤和風味的不足，紅曲粉添加量對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響見圖4。

圖4 紅曲粉添加量對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.4 Effects of red kojic rice addition on pH value，redness，sensory quality and nitrite residue of sausage

從圖4中可以看出，紅曲粉添加量在0.5 g～2.5 g時對產品pH值的影響不大。亞硝酸鹽殘留量呈現先降低并趨于平穩狀態，表明紅曲霉參與亞硝酸鈉的降解和轉化。繼續增大紅曲粉添加量時，產品紅度繼續增加，至2.5 g時，香腸呈現令人不愉悅的暗紅色甚至紅黑色，同時香腸也帶有酒糟味等異味。因此，紅曲粉的適宜添加量為1.5 g。

2.1.5 紅曲色素添加量對產品品質的影響

大量研究證實，將紅曲色素用于發酵香腸中替代部分亞硝酸鹽是可行的[32-34]，且不會影響產品的風味及品質。紅曲色素添加量對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響見圖5。

從圖5中可以看出，紅曲色素對發酵劑產酸有較大的影響，隨著添加量的增加，產品的pH值逐漸增高，當紅曲色素添加量＞40 mg時，產品的pH值＞5.66，這對于抑制腐敗菌和致病菌的生長，保證產品的安全性是非常不利的。隨著紅曲色素添加量的增加，產品顏色逐漸變成深紫色至紫黑色，影響制品的感官品質。當添加量為20 mg時，制品著色均勻品質較佳，因此，選擇紅曲色素的添加量為20 mg。

圖5 紅曲色素添加量對香腸pH值、紅度、感官品質及亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.5 Effects of red kojic pigment addition on pH value，redness，sensory quality and nitrite residue of sausage

2.2 正交試驗結果與分析

正交試驗結果見表3。

表3 正交試驗結果Table 3 The orthogonal experiment results

極差的大小可以反映各因素的影響程度，從表3可以看出，各因素對發酵香腸感官品質影響的大小順序為A＞C＞D＞B，即亞硝酸鈉添加量＞紅曲色素添加量＞復合發酵劑體積比＞紅曲粉添加量。根據產品感官評分的極差分析結果確定低亞硝酸鹽發酵香腸的最佳配方為亞硝酸鈉的添加量30 mg，紅曲色素添加量35 mg，復合發酵劑體積比（清酒乳桿菌∶肉葡萄球菌∶漢遜德巴利酵母菌）4∶0.5∶1，紅曲粉的添加量 1.5 g。

對感官評分的方差分析如表4所示。

表4 方差分析結果Table 4 Analysis of variance

從表4中可以看出，A（亞硝酸鈉添加量），B（紅曲粉添加量），C（紅曲色素添加量），D（復合發酵劑體積比）均對低亞硝酸鹽發酵香腸的感官品質有極顯著的影響（P＜0.01），影響的主次順序為 A＞C＞D＞B，進一步驗證了極差分析的結果。

在優化的工藝條件下，重新制備3批低亞硝酸鹽發酵香腸。對3批香腸產品進行感官品評，所得的香腸產品表面及瘦肉呈鮮艷均勻的玫瑰紅色，肥肉切片呈現透明狀；腸衣干燥且緊貼肉餡，無霉，堅實有彈性，具有發酵香腸特有的氣味及香味，不同批次香腸品質的穩定性良好。香腸的亞硝酸鹽含量為（0.026±0.003）mg/kg，遠低于30mg/kg的標準，香腸的pH值為5.09±0.07。使用紅曲霉及紅曲色素是有效的替代亞硝酸鹽的方法。將香腸置于室溫條件下（25℃左右）貯藏30 d后，檢測微生物指標，菌落總數為5CFU/g，其中大腸桿菌及致病性細菌（沙門氏菌、志賀氏菌及金黃色葡萄球菌）均未檢出，表明發酵香腸符合微生物安全性標準。

3 結論

本試驗使用紅曲粉及紅曲霉色素部分替換亞硝酸鹽的添加，研究低亞硝酸鹽發酵香腸的制備工藝。在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優化關鍵因素的參數，最終確定的工藝配方為豬瘦肉700 g、豬脂肪300 g、食鹽 20 g、葡萄糖 5 g、蔗糖 5 g、異抗壞血酸鈉0.4g、香辛料10g、亞硝酸鈉30mg、紅曲粉1.5g、紅曲色素35 mg，接種復合發酵劑（肉葡萄球菌∶清酒乳桿菌∶漢遜德巴利酵母菌）的體積比為4∶0.5∶1，通過48 h發酵（溫度22℃，相對濕度為85%～90%），干燥成熟2周后可以得到成品。此工藝條件下的低亞硝酸鹽的香腸pH值為5.09±0.07，感官評分最高，顏色誘人均勻，香氣濃郁，品質穩定，亞硝酸鹽殘留量遠低于國家標準要求，可為今后工業化應用提供一定的參考。