無核白綠葡萄干清洗前后酚類物質變化及其與酶促褐變的關系

雷 靜，廉葦佳，陳 雅，韓 琛，任紅松，肖 麗

(1.新疆農業科學院吐魯番農業科學研究所，新疆吐魯番 838000；2.新疆農業科學院科研管理處，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】葡萄干是葡萄的主要加工品之一，含糖量高，富含多種人體所需氨基酸、維生素和礦物質[1,2]。葡萄干含水量低，方便運輸和貯藏[3,4]。無核綠葡萄干是新疆特色干果制品，占全疆葡萄干的70%以上，傳統干制綠色葡萄干主要是采用蜂眼式透風晾房陰干方法[5,6]。綠葡萄干清洗會有褐變現象。分析無核白綠葡萄干清洗前后酚類物質變化及其與酶促褐變的關系，研究葡萄干清洗酶促褐變的原因，為綠葡萄干清洗技術提供理論依據[7,8]。【前人研究進展】白俊文[9]認為葡萄干燥加工中存在干燥時間長和褐變問題，將高溫高濕氣體射流沖擊燙漂技術(HHAIB)用于葡萄干燥前處理，研究了燙漂處理對葡萄PPO酶活性、葡萄干燥動力學以及色澤的影響；張利娟等[10]評價綠葡萄干干制過程中褐變的發生對其抗氧化活性的影響，分析了抑制無核白綠葡萄干褐變的方法。李曉麗等[11]研究了無核白葡萄干制過程中酚類物質的變化與葡萄干發生褐變的關系。最主要的酶促褐變底物為兒茶素[11]；Williamson and Carughi等[15]研究表明，葡萄干中最豐富的酚類化合物是槲皮素、山奈酚、酚酸以及咖啡酸和香豆酸。Breksa III A P等[16-20]。【本研究切入點】雖然研究葡萄干的文獻很多，但是專注研究葡萄干清洗褐變的研究報道較少。研究無核白綠葡萄干清洗前后酚類物質含量變化及與酶促褐變的關系。【擬解決的關鍵問題】分析無核白綠葡萄干清洗前后酚類物質含量變化及其與酶促褐變的關系，研究清洗無核白綠葡萄干發生酶促褐變的機理，為葡萄干精深加工提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 葡萄干

綠葡萄干于2018年12月購買自新疆吐魯番市東疆市場，品種為無核白(V.viniferacv. Thompson Seedless)。

1.1.2 試劑

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、甲醇、福林-肖卡試劑均為分析純；綠原酸、沒食子酸、阿魏酸、原兒茶酸、山奈酚、香草酸、咖啡酸、丁香酸、P-香豆酸、芥子酸、龍膽酸、兒茶素、槲皮素標準品購自Anpel公司。

1.1.3 儀器與設備

FA2004N電子天平，上海菁海儀器有限公司；UV754N紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；KQ-500E機械式超聲波清洗器，東莞康士潔超聲波科技有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司；全能臺式高速冷凍離心機，德國SIGMA公司；UPLC-Vion-IMS-QTof超高效液相-離子淌度飛行時間質譜，美國Waters公司；Scotsman AF 100 AS雪花制冷機，上海旦鼎國際貿易有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄干清洗

挑選無病蟲害，無損傷，大小均勻，色澤均一的葡萄干為材料。無核白綠葡萄干用常溫自來水清洗2遍，每次清洗時間1 min，于通風處自然晾干。

1.2.2 葡萄干褐變度的測定[12，13]

取3 g(干物質)葡萄干按1∶10加蒸餾水，勻漿后，在4℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液在420 nm處測OD值。

1.2.3 酚類物質組成測定

參照Kolniak-Ostek J等[14]方法。采用UPLC-Vion-IMS-QTof超高效液相-離子淌度飛行時間質譜進行酚類物質單體測定。色譜條件如下：色譜柱采用UPLC BEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，流動相由溶劑A(0.1%甲酸)和溶劑B(100%乙腈)組成。梯度洗脫：0～1 min，99%溶劑A；1～12 min，99%～0溶劑A；12～13.5 min，0～99%溶劑A；保持不變以重新平衡該柱子。流速0.45 mL/min，進樣量10 μL，柱溫45℃，進樣室溫10℃。質譜條件：毛細管電壓2 500V，錐形電壓30V，源溫度100℃，去溶劑化溫度300℃，脫溶劑氣體(氮氣)流量300 L/h，電壓斜坡循環從0.3到2V。

1.2.4 酚類物質標準曲線建立

利用UPLC-Vion-IMS-QTof超高效液相-離子淌度飛行時間質譜體系鑒定清洗前后無核白綠葡萄干中的主要酚類物質，確定各自的線性回歸方程，判斷該體系的分離度和方程的線性關系。

1.2.5 無核白綠葡萄干酶促褐變底物鑒定[15]

多酚氧化酶提取：準確稱取一定量葡萄干，加入18 mL 0.2 mol/L pH 5.8預冷的磷酸緩沖液，用均質機勻漿，在4℃條件下浸提2.9 h，在同樣4℃下9 000 r/min離心15 min，取其清液。重復1次，得到葡萄干多酚氧化酶提取液。

多酚氧化酶活性測定：在試管中加入3 mL 0.2 mol/L pH 6.8磷酸緩沖液，1 mL不同反應物(沒食子酸、龍膽酸、兒茶素、阿魏酸、香草酸、P-香豆酸、原兒茶酸、山奈酚、綠原酸、芥子酸、丁香酸、咖啡酸、槲皮素)，1 mL粗酶液，混合均勻，在420 nm吸收波長下測定其在4 min內的吸光度值，每隔30s測1次，根據公式(1)計算酶活。鑒定無核白綠葡萄干清洗酶促褐變的底物。

(1)

式中：△A為反應時間內吸光度值的變化；

Vr為提取酶液總體積(mL)；

W為取樣質量(g)；

Vs為測定時取用酶液體積(mL)；

t為反應時間(min)。

1.2.6 無核白綠葡萄干清洗前后褐變度與酚類物質含量變化之間的相關性

分別測定無核白綠葡萄干清洗前后的褐變度，使用SPSS軟件相關性分析法分析清洗前后無核白綠葡萄干褐變度與酚類物質含量變化的相關性。

1.3 數據處理

數據采用采用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析和相關性分析，當P<0.01時，差異極顯著，當P<0.05時，差異顯著。

2 結果與分析

2. 1 酚類物質標準曲線

研究表明，無核白葡萄中酚類物質有14種，參與酶促褐變的底物有6種，分別為順式-白藜蘆醇、原花青素B2、阿魏酸、兒茶素、反式-咖啡酸、對羥基肉桂酸，葡萄干中也含有兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、丁香酸、香草酸、綠原酸、原兒茶酸和阿魏酸等酚類物質。單體酚標準品確定各自的線性回歸方程，相關系數均達到0.999以上，線性關系好，檢測體系分離度好。鑒定出無核白綠葡萄干清洗前后有山奈酚、阿魏酸、原兒茶酸、香草酸、P-香豆酸、龍膽酸、兒茶素、綠原酸、芥子酸、丁香酸、沒食子酸、咖啡酸和槲皮素共計13種主要的酚類物質。表1

表1 無核白綠葡萄干中 13種酚類物質標準品的線性回歸方程Table 1 Linear regression Equations of 12 phenolics standards in green raisins

2.2 無核白綠葡萄干清洗前后酚類物質含量的變化

研究表明，無核白綠葡萄干在清洗前兒茶素含量最高，為0.105 mg/100g，龍膽酸含量最低，為0.001 mg/100g。綠葡萄干在清洗后兒茶素含量仍然最高，為0.052 mg/100g，綠原酸含量最低，為0.000 65 mg/100g。兒茶素在清洗前的含量就非常高，是其它單體酚類物質含量的幾十到100倍，在葡萄干清洗過程中損失一部分，但是其含量還是很高。綠葡萄干通過清洗干燥后沒食子酸、原兒茶酸的含量增加，增加的含量非常小，分別增加了9.83%和0.89%，其他酚類物質含量都是減少的，其中兒茶素和槲皮素含量減少的較多，分別減少了50.48%和57.25%。酚類物質減少大小依次為：P-香豆酸>槲皮素>綠原酸>兒茶素>山奈酚>丁香酸>阿魏酸>香草酸>咖啡酸>龍膽酸>芥子酸。綠原酸、阿魏酸、香草酸、咖啡酸和丁香酸的質量變化沒有顯著性差異，原兒茶酸、芥子酸和龍膽酸的質量變化沒有顯著性差異，兒茶素、槲皮素、山奈酚、P-香豆酸、沒食子酸的質量變化有顯著性差異。表2

表2 無核白綠葡萄干清洗前后單體酚類物質組成和含量變化Table 2 Changes in composition and content of monophenols in green raisins before and after cleaning

2.3 無核白綠葡萄干酶促褐變底物鑒定

研究表明，無核白綠葡萄干多酚氧化酶催化咖啡酸酶促褐變酶活是35.07 U/mL，催化綠原酸的酶活是3.48 U/mL。無核白綠葡萄干多酚氧化酶對主要酚類物質的催化褐變活性大小依次為咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>兒茶素>山奈酚>綠原酸，而葡萄干多酚氧化酶對阿魏酸，原兒茶酸、香草酸、龍膽酸、芥子酸、丁香酸、沒食子酸無反應活性。對比清洗前后，葡萄干中咖啡酸、P-香豆酸、槲皮素、兒茶素、山奈酚和綠原酸這幾種酚類物質含量也是減少的，P-香豆酸和槲皮素含量減少的最多，與多酚氧化酶反應酶活性值也較高，分別排在第2和第3，咖啡酸與多酚氧化酶反應酶活性值最高，但清洗后含量降低率僅為10.21%，咖啡酸與葡萄干多酚氧化酶的結合能力大于P-香豆酸和槲皮素與葡萄干多酚氧化酶的結合能力。不同酚類物質與葡萄干多酚氧化酶結合能力大小依次為咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>兒茶素>山奈酚>綠原酸，而阿魏酸、原兒茶酸、香草酸、龍膽酸、芥子酸、丁香酸和沒食子酸與葡萄干多酚氧化酶不結合或基本不結合，葡萄干多酚氧化酶可以與多種酚類物質反應，而不是具有特異性底物。無核白綠葡萄干清洗前后酚類物質減少是被多酚氧化酶催化氧化成醌類物質所致，醌類物質自聚或與其他物質聚合而生成褐色或褐色物質，導致清洗后葡萄干褐變。無核白綠葡萄干清洗酶促褐變的底物主要是槲皮素、綠原酸、咖啡酸、P-香豆酸、山奈酚和兒茶素。阿魏酸、香草酸、龍膽酸、芥子酸和丁香酸不與或者基本不與葡萄干多酚氧化酶結合，可能會與苯丙氨酸解氨酶或過氧化物酶等酶結合反應。原兒茶酸和沒食子酸清洗后含量增加但不與多酚氧化酶反應，可能清洗過程中由于水分進入葡萄干內部，內部成分之間發生化學反應，導致2種物質含量都有增加，原兒茶酸含量僅增加了0.89%，沒食子酸增加較多，增加了9.83%。表3

表3 無核白綠葡萄干多酚氧化酶對不同底物催化酶活性Table 3 Catalytic browning activity of green raisin polyphenol oxidase on different substrates

2.4 無核白綠葡萄干清洗前后褐變度與酚類物質含量變化之間的相關性

研究表明，無核白綠葡萄干清洗前后褐變度與清洗中酶促褐變的底物山奈酚、咖啡酸、P-香豆酸、兒茶素和槲皮素呈顯著負相關(P<0.05)，相關性大小由高到低是咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>兒茶素>山奈酚>綠原酸，山奈酚、咖啡酸、P-香豆酸、兒茶素和槲皮素對無核白綠葡萄干清洗后褐變的影響顯著。綠原酸與無核白綠葡萄干褐變度的相關性最小為-0.866，且相對于其它5種酚類物質對褐變度的影響不顯著。表4

表4 無核白綠葡萄干清洗前后褐變度與酚類物質含量變化之間的相關性Table 4 Correlation between browning degree and phenol content before and after cleaning seedless green raisins

3 討 論

褐變通常分為酶促褐變和非酶褐變兩類。酶促褐變是指在氧氣存在的條件下，多酚氧化酶催化酚類物質向醌及其聚合物轉變的過程，反應生成褐色素或黑色素造成褐變現象的發生。非酶褐變則是指沒有酶參與時發生的褐變，主要包括美

拉德反應和焦糖化反應[21]。有研究表明，有些水果的褐變不僅與多酚氧化酶(PPO)活性有關，還與酚類物質的濃度有關，也有些水果的褐變僅僅與PPO活性相關。李曉麗等[11]研究得出無核白葡萄主要酚類物質單體中有6種酚類單體與多酚氧化酶發生反應，即原花青素B2、對羥基肉桂酸、兒茶素、反式-咖啡酸、順式-白藜蘆醇、阿魏酸。在干制過程中褐變度與總酚、原花青素B2、對羥基肉桂酸、兒茶素、反式-咖啡酸、順式-白藜蘆醇呈顯著相關性。Hogan等[22]認為葡萄的褐變度與總酚、原花青素、兒茶素和根皮苷相關性較高。

前人大多從葡萄干制過程中發生酶促褐變的角度開展試驗研究。但是圍繞無核白綠葡萄干清洗褐變的研究非常少，研究主要針對無核白綠葡萄干清洗干燥后發生的酶促褐變開展研究，通過試驗分析發現，參與葡萄干清洗酶促褐變的酚類物質與葡萄干制過程中的酚類物質不同。酚類物質與多酚氧化酶反應的活性也不同。無核白綠葡萄干清洗前后主要酚類物質單體中有6種酚類單體與多酚氧化酶發生反應，主要為槲皮素、兒茶素、咖啡酸、山奈酚、P-香豆酸、綠原酸。

葡萄干清洗干燥后發生的褐變主要是酶促褐變，但是非酶促褐變也伴隨其中，這主要是因為葡萄干中的糖分為68 g/100g左右，在清洗之后，需要用熱泵干燥機快速干燥，干燥溫度為45℃左右。葡萄干在這樣的溫度之下會發生一定程度的焦糖化反應[23]。這樣就會影響無核白綠葡萄干的顏色，發生輕微的非酶促褐變。

4 結 論

4.1無核白綠葡萄干清洗前后P-香豆酸、槲皮素、兒茶素等11種酚類物質含量減少。

4.2無核白綠葡萄干多酚氧化酶對主要酚類物質的催化褐變活性大小依次為咖啡酸>P-香豆酸>槲皮素>兒茶素>山奈酚>綠原酸，而葡萄干多酚氧化酶對阿魏酸、原兒茶酸、香草酸、龍膽酸、芥子酸、丁香酸和沒食子酸無反應活性。說明無核白綠葡萄干清洗酶促褐變的底物主要是槲皮素、綠原酸、咖啡酸、P-香豆酸、山奈酚和兒茶素。

4.3咖啡酸、P-香豆酸、槲皮素、兒茶素和山奈酚這5種酚類底物含量變化與葡萄干清洗前后褐變度有顯著的相關性，這5種酚類物質對無核白綠葡萄干清洗褐變度的影響顯著，而綠原酸對清洗褐變度的影響不顯著。

4.4酚類物質咖啡酸、P-香豆酸、槲皮素、兒茶素、山奈酚和綠原酸含量低的綠葡萄干在清洗過程中褐變程度較小，將此6種酚類物質含量作為葡萄制干品種選擇和葡萄育種的一項指標。