硒結合蛋白1基因沉默對巨噬細胞硒蛋白表達水平的影響*

賈義， 代杰， 楊潔， 張亮亮， 曾柱

(貴州醫科大學 生物與工程學院， 貴州 貴陽 550025)

硒是人體和哺乳動物所必需的微量元素，具有抗氧化、提高紅細胞攜氧能力及提高人體免疫力、解毒排毒抗污染等作用，亦與腫瘤等多種疾病相關[1]。硒的生物功能主要是通過硒蛋白實現，通過實驗和生物信息學的方法已經從人類基因組中發現了25種硒蛋白[2]。硒結合蛋白1(selenium-binding protein 1，SBP1)是一種結合硒原子的含硒蛋白，于1989年被發現，主要定位于細胞質和細胞核[3-5]；與正常組織器官相比，癌組織中的SBP1表達水平存在顯著下降甚至丟失[6-7]，比如胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌和乳房癌等。缺氧誘導因子(hypxia-inducible factor-lalpha，HIF-la)參與了腫瘤血管的生成和能量代謝，而SBP1蛋白表達水平的明顯下降增加了HIF-1a的穩定性[8]，因此，SBP1可能成為潛在的抗腫瘤靶點[9]。巨噬細胞具有吞噬和趨化性遷移的作用[10-11]，是人體非特異性免疫的重要一員，在腫瘤增殖、侵襲、轉移中發揮重要作用[12]，巨噬細胞在原發和繼發腫瘤中被稱為腫瘤相關巨噬細胞，是腫瘤間質中細胞數量最多的群體[13]。研究發現，硒蛋白參與了免疫功能的調節，硒蛋白K(selenoprotein K，SELENOK)敲除可以影響T細胞的增殖和遷移[14]、硒蛋白T(selenoprotein T，SELENOT)參與了免疫相關細胞因子的表達調控[15]、蛋氨酸亞砜還原酶B1(methionine sulfoxide reductase B1，MSRB1)參與了巨噬細胞中抗炎癥因子的表達[16]；此外，硒蛋白S(selenoprotein S，SELENOS)、硒蛋白F(selenoprotein F，SELENOF)和谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)也參與了免疫應激[17]。考慮到巨噬細胞和SBP1在癌癥發展中的作用以及硒蛋白對免疫功能的調節，沉默SBP1基因是否對巨噬細胞中硒蛋白的表達具有調節作用是一個值得研究的方向。本項目將單核細胞株THP-1分化為M0型巨噬細胞，檢測SBP1基因沉默對巨噬細胞硒蛋白表達水平的影響，為SBP1參與調節巨噬細胞功能提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 人單核細胞株THP-1購于美國模式培養物集存庫(american type culture collection, ATCC)。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI 1640培養基、胎牛血清、雙抗購于美國Gibco公司，佛波酯購于北京索來寶科技有限公司，引物序列由上海生工生物合成，Lipofectmine 3000、Trizol購于美國Invitrogen公司，PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix kit購于美國Thermo 公司，SBP1和GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司。CO2培養箱、實時熒光定量PCR儀購于美國Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 THP-1細胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養基在37 ℃、5% CO2培養箱內培養，用50 μg/L的佛波酯誘導培養48 h后獲得M0巨噬細胞。

1.2.2基因沉默 將M0巨噬細胞接種于6孔板中，分為空白對照組(C組，含轉染試劑)、陰性對照組(NC組, 含轉染試劑和陰性對照引物)和沉默組(Si組, 含轉染試劑和SBP1 siRNA引物)，培養24 h后根據Lipofectmine 3000轉染試劑說明對細胞進行轉染，轉染24 h或48 h后收集細胞用于后續檢測。SBP1 siRNA上下游引物序列分別為5′-CUUGGAGGCACCAAGAAAUTT-3′(sense)，5′-AUUUCUUGGUGCCUCCAAGTT-3′(antisense)。陰性對照上下游引物序列分別為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(sense)，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′(antisense)。

1.2.3SBP1和硒蛋白基因表達檢測 使用Trizol試劑從M0巨噬細胞提取總RNA，用隨機引物和逆轉錄酶合成cDNA，按照試劑盒說明進行實時熒光定量PCR反應。SBP1和硒蛋白(GPX1、SELENOH、SELENOK、SELENOS、SELENOT、SELENOV、SELENOW、TXNRD3和SEPHS2)的引物序列見表1。PCR反應條件參照SYBR Green PCR Master Mix kit設置，以GAPDH基因為內參，利用2-ΔΔCT方法計算目標基因的表達水平[18]。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 List of primers for real-time PCR

1.2.4SBP1蛋白表達檢測 收集處理好的細胞后用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取60 μg樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉膜后經一抗孵育，SBP1和GAPDH抗體稀釋比例分別為1 ∶1 000和1 ∶3 000。二抗孵育后用ECL發光液進行檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 SBP1 mRNA表達水平

基因轉染實驗結果表明，在SBP1基因沉默巨噬細胞中，SBP1 mRNA表達水平被抑制了76%左右，與對照組(C組)相比差異具有統計學意義(P<0.001，圖1)，表明巨噬細胞中SBP1的mRNA表達被抑制。

注：(1)與C組比較，P<0.001。圖1 SBP1基因沉默后巨噬細胞SBP1 mRNA的表達水平Fig.1 SBP1 mRNA expression level in SBP1-gene silencing macrophage

2.2 SBP1蛋白表達水平

結果顯示，在SBP1基因沉默的巨噬細胞中， SBP1蛋白水平被抑制了50%，與C組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。表明巨噬細胞中SBP1蛋白的表達被抑制。

注：(1)與C組比較，P<0.05。圖2 SBP1基因沉默后巨噬細胞SBP1蛋白表達水平Fig.2 SBP1 protein expression level in SBP1-gene silencing macrophage

2.3 SBP1基因沉默對巨噬細胞中硒蛋白mRNA表達水平的影響

硒蛋白基因表達檢測結果顯示，在SBP1基因沉默的巨噬細胞中，硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA表達明顯上調(P<0.001)，硒蛋白MSRB1、SELENOT和SELENOWmRNA表達明顯下調(P<0.01)，硒蛋白SELENOVmRNA表達量不變(P>0.05)。見圖3。

注：與C組比較，(1)P<0.001,(2)P<0.01。圖3 SBP1基因沉默后巨噬細胞中硒蛋白mRNA表達水平的變化Fig.3 Changes of selenprotein mRNA levels in macrophages after SBP1 gene silencing

3 討論

硒主要以硒蛋白的形式存在于體內，研究發現，硒蛋白在免疫反應等多方面發揮重要的生理作用[19]。而巨噬細胞是非特異性免疫系統中主要的效應細胞，可通過多種途徑影響其他免疫細胞的功能活性，對于特異性免疫應答也起著重要的作用[19]。近年來，研究發現硒蛋白對巨噬細胞功能具有重要的調節著作用[19]。為了進一步研究SBP1對巨噬細胞中部分硒蛋白的影響，本實驗以單核細胞株THP-1誘導的巨噬細胞為研究對象，分析了SBP1基因沉默對硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK、SELENOS、MSRB1、SELENOT、SELENOW和SELENOVmRNA表達的影響，這對深入了解SBP1是否參與巨噬細胞的免疫功能具有重要意義。

SELENOK、SELENOS、SELENOT、SELENOW是內質網定位硒蛋白，在鈣穩態調節、氧化應激和內質網應激調節等方面發揮重要作用，均參與了免疫功能的調節[14-15,17,20]。SELENOH通過氧化還原作用參與人體內各種生理作用[21]，可以調節癌細胞的增殖[22]，在LPS誘導的小鼠巨噬細胞中表達量下降[23]；MSRBl位于細胞核與細胞質，具有氧化還原活性，可調節巨噬細胞中抗炎因子的表達[16]；GPX1具有抗氧化作用，是谷胱甘肽過氧化物酶家族成員，GPX1敲除小鼠可以導致巨噬細胞數量減少[24]；TXNRD3是硫氧還蛋白還原酶，在硫氧還蛋白存在時，具有氧化還原活性，參與胰島素中炎癥的調節。研究表明，GPX1與TXNRD可以發揮互補作用，在調節免疫應答平衡過程中發揮關鍵作用；GPX1與SELENOW之間存在一定的代償性，SELENOW表達降低可導致GPX1表達升高[25]。這與本文的研究結果一致。人結腸直腸癌或乳腺癌中SBP1的過表達可以導致GPX1酶活的減少，GPX1表達增加會導致SBP1的轉錄和翻譯抑制，表明GPX1和SBP1表達水平呈負相關[11]。本文結果顯示巨噬細胞中SBP1被抑制后，GPX1表達水平升高。

根據本文的研究結果，可以推測SBP1與部分硒蛋白之間存在一種補償機制，當SBP1表達降低時，SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA的表達升高，而SBP1與MSRB1、SELENOT和SELENOW的表達存在正相關性。因此，探討SBP1基因沉默對巨噬細胞中硒蛋白表達水平的影響，研究SBP1與硒蛋白組之間可能存在的補償機制，為SBP1參與巨噬細胞免疫功能的調節提供了實驗依據。

總之，SBP1基因沉默的巨噬細胞，硒蛋白SEPHS2、SELENOH、TXNRD3、GPX1、SELENOK和SELENOSmRNA表達上調，硒蛋白MSRB1、SELENOT和SELENOWmRNA表達下調，硒蛋白SELENOVmRNA表達不變。SBP1基因沉默可以調節巨噬細胞硒蛋白的表達。