抗早顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

錢芳，陳煜

(江蘇省中醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210029)

性早熟是一種生長發(fā)育異常疾病，主要表現(xiàn)為第二性征提前出現(xiàn)，青春期提前開始，可造成患兒矮身材、性格壓抑等[1]。抗早顆粒為臨床經(jīng)驗方，由黃柏、知母、枳殼、夏枯草、陳皮等十味中藥組成，具有滋陰降火、疏肝理氣化痰之功效，用于兒童性早熟的治療。黃柏、知母共為君藥，同用滋陰降火。采用薄層色譜法(TLC)對知母、枳殼、夏枯草進(jìn)行定性鑒別，使用高效液相色譜法(HPLC)測定黃柏中主要有效成分鹽酸小檗堿[2-3]的含量，旨在完善和提高抗早顆粒質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100 液相色譜儀：美國Agilent公司；Millipore-Q純水機：美國Millipore公司； 1/10萬電子分析天平：BP-211D型，德國Sartorius公司。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品：批號110713-201212，含量86.7%。知母、枳殼、夏枯草對照藥材：批號分別為121070-201105、120981-201605、120993-201105，均購于中國食品藥品檢定研究院。抗早顆粒：批號202004001、202004002、202004003，院內(nèi)制劑。乙腈：批號1758107446，德國Merck公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 知母

供試品溶液：取樣品(批號202004001、202004002、202004003)10 g，用40 ml水溶解，正丁醇提取(30 ml×2次)，正丁醇液蒸干后加乙醇40 ml、鹽酸4 ml，回流1 h。再加水20 ml，石油醚(60～90 ℃)提取(40 ml×2次)，石油醚液蒸干，加乙酸乙酯1 ml溶解。同法制得知母陰性溶液。

對照藥材溶液：另取知母對照藥材1 g，加稀乙醇20 ml、鹽酸2 ml，回流1 h，濾過，濾液蒸干，加乙酸乙酯1 ml溶解。

展開條件：硅膠G板；點樣量5 μl；展開劑為甲苯-丙酮(體積比9∶1)；顯色劑為5%香草醛硫酸溶液；105 ℃加熱。

結(jié)果顯示供試品有鑒別點，陰性無干擾，見圖1A。

2.1.2 枳殼

供試品溶液：取樣品(批號202004001、202004002、202004003)10 g，用40 ml水溶解，乙酸乙酯提取(40 ml×2次)，提取液蒸干，加甲醇1 ml溶解。同法制得枳殼陰性溶液。

對照藥材溶液：另取枳殼對照藥材0.5 g，加甲醇10 ml，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇2 ml溶解。

展開條件：硅膠G板；點樣量5 μl；展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲醇(體積比5∶10∶2)；顯色劑為10%硫酸乙醇液；105 ℃加熱，365 nm下檢視。

結(jié)果顯示,供試品有鑒別點,陰性無干擾,見圖1B。

2.1.3 夏枯草

供試品溶液：取樣品(批號202004001、202004002、202004003)10 g，用40 ml水溶解，乙酸乙酯提取(40 ml×2次)，提取液蒸干，加甲醇1 ml溶解。同法制得夏枯草陰性溶液。

對照藥材溶液：另取夏枯草對照藥材1 g，加水50 ml，煎煮1 h，濾過，濾液同法制備。

展開條件：硅膠G板；點樣量5 μl；展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸(體積比8∶4∶1.2)；顯色劑為5%三氯化鐵乙醇液；105 ℃加熱。

結(jié)果顯示供試品有鑒別點，陰性無干擾，見圖1C。

2.2 鹽酸小檗堿的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比45∶55)，每100 ml加十二烷基磺酸鈉0.1 g。檢測波長265 nm，流速1.0 ml·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿對照品，加流動相溶解制成353.74 μg·ml-1的貯備液。取貯備液1 ml，加流動相定容至25 ml(14.15 μg·ml-1)。

2.2.2.2 供試品溶液 取樣品(批號202004001)0.5 g，加流動相，超聲(功率250 W、頻率40 kHz)20 min，加流動相定容至25 ml，搖勻，取續(xù)濾液。同法制備黃柏陰性溶液。

2.2.3 專屬性試驗

分別取“2.2.2”項下3種溶液各10 μl，進(jìn)樣，測定。結(jié)果見圖2。

2.2.4 線性關(guān)系分析

取對照品貯備液(353.74 μg·ml-1)，用流動相稀釋至88.435、44.218、22.109、11.054、5.527、2.764 μg·ml-1，進(jìn)樣，測定。以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=47.241X+ 3.234 3，r=1.000 0(n=6)。鹽酸小檗堿在2.764～88.435 μg·ml-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗

取對照品溶液(14.15 μg·ml-1)10 μl，按“2.2.1”色譜條件，測定峰面積，RSD=0.67%(n=6)。表明儀器有良好的精密度。

A. 知母；B. 枳殼；C. 夏枯草。1.對照藥材；2、3、4. 供試品(批號202004001、202004002、202004003)；5. 陰性

2.2.6 重復(fù)性試驗

取樣品(批號202004001)0.5 g，共6份，按“2.2.2.2”方法制備供試液，測定。鹽酸小檗堿平均含量為0.691 mg·g-1，RSD=1.18%(n=6)。表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試液(批號202004001)，放置0、2、4、6、8、12 h，按“2.2.1”色譜條件測定，峰面積RSD=0.67%(n=6)。表明供試液12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收試驗

取樣品(批號202004001，含量0.696 mg·g-1)0.25 g，共9份，加入鹽酸小檗堿對照品，按“2.2.2.2”方法制備供試液，測定。結(jié)果見表1。

2.2.9 樣品含量測定

取樣品(批號202004001、202004002、202004003)，按“2.2.2.2”方法制備供試液，按“2.2.1”色譜條件測定。鹽酸小檗堿含量分別為0.696、0.698、0.684 mg·g-1。

3 討 論

3.1 TLC條件選擇

3.1.1 知母的TLC鑒別

知母含有知母皂苷BⅡ、菝葜皂苷元、芒果苷等[4-5]。參考藥典[6]以乙醇-水(體積比1∶1)為展開劑以及文獻(xiàn)[7]以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(體積比5∶3∶1∶1)為展開劑，鑒別知母中的芒果苷，未見鑒別點；以正丁醇-冰醋酸-水(體積比4∶1∶5)[6]為展開劑，鑒別知母皂苷BⅡ，也未見鑒別點；而參考文獻(xiàn)[8]方法提取樣品，以甲苯-丙酮(體積比9∶1)為展開劑，鑒別菝葜皂苷元，斑點清晰，專屬性強。

3.1.2 枳殼的TLC鑒別

枳殼和陳皮中均含有橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷[9-11]。以乙酸乙酯-甲醇-水(體積比10∶2∶3)上層溶液[12]、二氯甲烷-甲醇-水(體積比13∶6∶2)下層溶液[13]、三氯甲烷-丙酮-甲醇(體積比5∶1∶1)[14]為展開劑，鑒別點陰性有干擾；而以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(體積比5∶10∶2)[15]為展開劑，鑒別點清晰，陰性無干擾。

3.1.3 夏枯草的TLC鑒別

夏枯草中主要含有酚酸類、萜類[16-18]。參考藥典以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(體積比15∶3∶3.5∶0.5)[19]，參考文獻(xiàn)以乙酸乙酯-甲酸-水(體積比8∶1∶1)[20]、三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水(體積比7∶2∶0.5∶0.3)[21]為展開劑，未見鑒別點；而以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(體積比8∶4∶1.2)[22]為展開劑，鑒別點清晰，專屬性強。

3.2 流動相的選擇

曾以乙腈-水、乙腈-磷酸水為流動相，結(jié)果鹽酸小檗堿色譜峰出現(xiàn)拖尾，而用本研究流動相時，出峰時間適中，峰形較好，分離度>1.5。

3.3 提取方法和提取條件的選擇

分別用超聲(功率250 W、頻率40 kHz)和回流30 min的方法提取樣品，結(jié)果鹽酸小檗堿含量無明顯差異。因用超聲方法提取樣品較為簡單快捷，故選擇此法。

用流動相、不同濃度甲醇和乙醇超聲(功率250 W、頻率40 kHz)30 min提取樣品，結(jié)果流動相最佳。

樣品加流動相，分別超聲(功率250 W、頻率40 kHz)20、30、40 min，結(jié)果鹽酸小檗堿含量無明顯差異，故選擇超聲時間為20 min。

3.4 色譜柱考察

試驗中使用Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hedera C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，不同色譜柱含量無明顯差異，且有較好的分離度。

3.5 結(jié)論

建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于抗早顆粒的質(zhì)量控制。