葉綠素a測定方法的改進

李偉明

（福建省泉州環(huán)境監(jiān)測中心站，福建 泉州 362000）

葉綠素a是反映水體初級生產力的首要指標，也是評價水體富營養(yǎng)化水平的重要參數[1]。環(huán)境保護部[2]發(fā)布的《水質 葉綠素a的測定 分光光度法》（HJ 897—2017，下稱國標法）在地表水環(huán)境監(jiān)測中應用最廣泛，以90.0%丙酮為溶劑研磨提取葉綠素a。該方法過程煩瑣、耗時較長，容易因為多次轉移樣品產生操作誤差和受光降解反應影響導致測定結果失真。為了優(yōu)化葉綠素a的提取過程、提高監(jiān)測數據的準確性，本研究探討了葉綠素a的提取方法。

提取葉綠素a的關鍵在于對細胞壁進行有效的破壞。現代動植物細胞破壁技術主要有超聲波法、珠磨法、化學滲透法[3-4]。超聲波法和珠磨法被廣泛應用于實驗樣品的研磨與提取，本研究在此基礎上改進方法。在實驗室中，分別用研磨法和超聲波法對泉州市某水庫水樣的葉綠素a進行多次測定及比較，證實將超聲波法和珠磨法應用于葉綠素a的測定是可行的，實驗取得了令人滿意的結果。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

（1）儀器：分光光度計（Ⅴ-1800，上海美譜達儀器有限公司），離心機（TDZ5-WS，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），超聲儀（杭州飛華環(huán)保器材廠），抽濾裝置。

（2）試劑：90.0%丙酮，1.0%碳酸鎂懸濁液。

1.2 樣品采集及處理

使用有機玻璃采水器采集泉州市某水庫某斷面表層、中層及底層水樣，采樣體積為1.0 L，轉移至1.0 L配有磨口塞的棕色玻璃瓶中，每升樣品加1 mL碳酸鎂懸濁液，以防止酸化引起色素波長偏移，同時套上黑色布袋避光保存。

1.3 國標法制備試樣

準確量取500 mL混勻水樣，用0.45 μm玻璃纖維濾膜進行抽濾，再用少量蒸餾水清洗濾器壁，在樣品剛剛完全通過濾膜時結束抽濾，用鑷子取下濾膜，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干濾膜水分。將樣品濾膜置于研缽中，加入3～4 mL 90.0%丙酮，研磨至糊狀，補加3～4 mL 90.0%丙酮繼續(xù)研磨。保證充分研磨5 min以上，將完全破碎的細胞提取液轉移至10 mL具塞刻度離心管中，用丙酮沖洗研缽和研磨杵，一并轉移至離心管中，定容至10 mL。混勻后于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h，在浸泡過程中顛倒混勻3次。用離心機以4 000 r/min離心10 min，用針式過濾器過濾上清液得到丙酮提取液（試樣），待測。

1.4 珠磨法制備試樣

準確量取500 mL混勻水樣，用0.45 μm玻璃纖維濾膜進行抽濾，再用少量蒸餾水清洗濾器壁，在樣品剛剛完全通過濾膜時結束抽濾，用鑷子取下濾膜，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干濾膜水分。將樣品對折后置于15 mL具塞刻度離心管中，用90.0%丙酮溶液定容至10 mL標線后加入3顆不銹鋼珠。將離心管置于研磨儀中，在50 Hz的頻率下振動研磨 5 min后，于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h，在浸泡過程中顛倒混勻3次。用離心機以4 000 r/min離心10 min，用針式過濾器過濾上清液得到丙酮提取液（試樣），待測。

1.5 超聲波法制備試樣

準確量取500 mL混勻水樣，用0.45 μm玻璃纖維濾膜進行抽濾，再用少量蒸餾水清洗濾器壁，在樣品剛剛完全通過濾膜時結束抽濾，用鑷子取下濾膜，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干濾膜水分。將樣品對折后置于15 mL具塞刻度離心管中，用90.0%丙酮溶液定容至10 mL標線。將離心管置于50 ℃水浴中，在100 Hz的頻率下超聲破碎20 min后，于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h，在浸泡過程中顛倒混勻3次。用離心機以4 000 r/min離心10 min，用針式過濾器過濾上清液得到丙酮提取液（試樣），待測。

1.6 樣品的測定

將用不同方法制備的試樣移至1 cm比色皿中，以90.0%丙酮溶液為參比溶液，于波長750、664、647、630 nm處測量吸光度[2]。用下式計算葉綠素a的質量濃度。

式中：ρ為試樣中葉綠素a的質量濃度，mg/L；A750為試樣在750 nm波長下的吸光度；A664為試樣在664 nm波長下的吸光度；A647為試樣在647 nm波長下的吸光度；A630為試樣在 630 nm波長下的吸光度；V為提取液定容后的體積，mL；0.5為本次水庫水樣的體積，L。

2 實驗結果與討論

2.1 比對實驗

采集泉州市某水庫同一斷面表層、中層及底層水樣，分別用國標法、珠磨法及超聲波法制備7個試樣進行測定分析。通過對3種方法測定結果（見表1）的比對分析發(fā)現，測定結果有明顯差異，超聲波法與珠磨法的測定值明顯高于國標法，從相對標準偏差可以看出，超聲波法與珠磨法的平行性差異不明顯，離散情況優(yōu)于國標法。

表1 實際水樣精密度測定結果

2.2 原因分析

通過驗證發(fā)現，超聲波法與珠磨法的測定值相近且高于國標法，平行性優(yōu)于國標法。根據同系統(tǒng)專家意見，在實驗過程中，由于國標法需要進行2～3次人工研磨，在提取葉綠素a的過程中，每個樣品要光照約20 min，葉綠素a容易發(fā)生光敏降解反應。查閱相關文獻發(fā)現，葉綠素a在高溫和光照條件下能降解。在15 ℃、正午日照條件下，葉綠素a的降解半衰期為6～7 min，在日光燈照射下為5.5 h，在黑暗處為23 d[5]。此外，按照國標法操作，樣品提取液在多次轉移過程中容易損失，影響測定結果的準確性和精密度。因此，超聲波法及珠磨法的提取過程基本在密閉容器中的黑暗處進行，環(huán)境溫度控制在室溫20 ℃左右，可以有效減少高溫及光照對葉綠素a降解的影響，同時不需要對樣品提取液進行再次轉移，避免了轉移造成的樣品損失，能保證較高的提取效率。

3 結論

（1）丙酮是低毒物質，主要對中樞神經起麻醉作用，濃度較高時會引起耳鼻等部位的炎癥，特別嚴重的情況下甚至會造成昏迷。相比于國標法，超聲波法和珠磨法減少了操作人員和丙酮的接觸，保護了操作人員的身體健康，而且實驗步驟簡單、耗時短，減少了樣品轉移、研磨不完全和光敏降解反應造成的樣品損失，提高了實驗的準確性和精確性。

（2）通過不同方法的實驗室比對發(fā)現，超聲波法的相對標準偏差范圍在1.8%～3.3%，珠磨法的相對標準偏差范圍在1.5%～4.0%，國標法的相對標準偏差范圍在4.9%～5.4%，可見超聲波法及珠磨法的精密度優(yōu)于國標法，滿足環(huán)境監(jiān)測分析要求，適合在環(huán)境監(jiān)測工作中推廣應用。