柿葉中單寧的提取工藝

林 蓂，楊 姍，吳靜瀾，2，3，張天生，張高紅

（1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；3.國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；4.貴州康琦藥械有限公司，貴州 惠水 550600）

柿葉為柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬（Diospyros L.）植物柿（Diospyros kaki）的新鮮或干燥葉子，主要含有有機酸、黃酮、三萜及多酚等有效化學成分[1]，其中，多酚類成分主要為單寧。有試驗證明，多酚類物質具有較強的抗氧化作用以及清除自由基的能力[2-3]，在護膚品中有抗氧化、抗衰老、抗紫外線、增白等多種作用[4]，所以柿葉提取物常作為美容護膚的原料。但目前關于柿葉中單寧提取方法的研究較少，且單寧的提取率不高[5]。為了提高柿葉中單寧的提取率，本研究以水為溶劑對柿葉中的單寧進行提取工藝研究，并通過正交試驗法對提取工藝進行優化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計（UⅤ-5900，上海元析儀器有限公司）、電熱鼓風干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、恒溫水浴鍋、電子天平等。

1.2 試藥

柿葉經貴州中醫藥大學藥學院鑒定教研室丁寧老師鑒定為正品。沒食子酸對照品（110831-201605，中國食品藥品檢定研究院），鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、鹽酸、硫酸鋰、無水碳酸鈉等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 柿葉中單寧質量分數的測定

2.1.1 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液的配制

于250.0 mL圓底燒瓶中加入鎢酸鈉8 g、鉬酸鈉2 g、蒸餾水56.0 mL、磷酸4.0 mL及鹽酸8.0 mL，充分混勻，文火加熱回流2.0 h后，去冷凝管，加入硫酸鋰4 g、蒸餾水4.0 mL，混勻，定容于100.0 mL棕色容量瓶中[6]。

2.1.2 對照品溶液的制備

精確稱取沒食子酸標準品2.53 mg，加入蒸餾水定容于100.0mL棕色容量瓶中，得質量濃度為0.025 3 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 標準曲線的建立

精確吸取1.0、1.2、2.0、3.0、4.0、5.0 mL沒食子酸對照品溶液，分別加入1.5 mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液、10.0 mL蒸餾水，用70 g/L Na2CO3定容于25.0 mL棕色容量瓶中，30 ℃顯色1.5 h后，在765 nm下測得溶液吸光度[7]。以沒食子酸對照品溶液的質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖，得標準曲線（見圖1）：y=116.19x+0.025 4，r=0.999 9，R2=0.999 8。

圖1 沒食子酸溶液標準曲線

2.1.4 柿葉中單寧的提取及測定方法

稱取適量柿葉，加入一定比例的蒸餾水，置于恒溫水浴鍋中加熱回流，過濾得到濾液，定容后取待測樣品溶液 1.0 mL，與對照品同法測定吸光度，以標準曲線計算單寧的質量分數。

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同種類柿葉中單寧質量分數的比較

分別取新鮮柿葉、干燥新鮮柿葉與干燥落柿葉各1 g，以水為提取溶劑，料液比為1∶30，在100 ℃條件下提取1次，提取時間為1.0 h，測得單寧質量分數作為評價指標（見圖2）。

圖2 不同種類柿葉中單寧的質量分數

由圖2可知，干燥新鮮柿葉中單寧的質量分數高于新鮮柿葉和干燥落柿葉，因此，選用干燥新鮮柿葉進行后續工藝優化試驗。

2.2.2 提取時間的考察

取干燥新鮮柿葉1 g，以水為提取溶劑，料液比為1∶30，在60 ℃條件下提取1次，以提取時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h時測得的單寧質量分數作為評價指標（見圖3）。

圖3 提取時間對柿葉單寧提取率的影響

由圖3可知，適當延長提取時間可提高單寧的提取率，但隨著時間的延長，單寧提取率的提升逐漸平緩，因此，應選擇合適的提取時間進行提取以提高效率。

2.2.3 提取溫度的考察

取干燥新鮮柿葉1 g，以水為提取溶劑，料液比為1∶30，提取時間為1.0 h，提取1次，以提取溫度分別為室溫29、40、60、80、100 ℃時測得的單寧質量分數作為評價指標（見圖4）。

圖4 提取溫度對柿葉單寧提取率的影響

由圖4可知，溫度對單寧提取率的影響較大，較高的溫度對單寧的提取有利。但由于單寧的化學性質較為活潑，在高溫下易發生化學反應，因此，應在適當的溫度下進行提取。

2.2.4 料液比的考察

取干燥新鮮柿葉1 g，以水為提取溶劑，在60 ℃條件下提取1.0 h，提取1次，以料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50時測得的單寧質量分數作為評價指標（見圖5）。

圖5 料液比對柿葉單寧提取率的影響

由圖5可知，隨著浸提液的增加，單寧的提取率先提升后趨于平穩，在一定料液比下，大部分有效成分被完全提取，因此，應選取合適的料液比以免造成浪費。

2.2.5 提取次數的考察

取干燥新鮮柿葉1 g，以水為提取溶劑，料液比為1∶30，在60 ℃條件下提取1、2、3、4、5次，測得單寧質量分數作為評價指標（見圖6）。

由圖6可知，并非提取的次數越多越好，提取3次之后，單寧提取率的提升幅度減小，說明大部分單寧已被提取，因此，從效率方面考慮，應提取3次。

圖6 提取次數對柿葉單寧提取率的影響

2.3 正交試驗法優化提取工藝

根據單因素試驗結果，確定單寧提取率的影響因素主要為提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C），建立因素水平表L9（34）（見表1），以單寧質量分數和出膏率為評價指標進行正交試驗，結果如表2所示。

表1 因素水平

表2 正交試驗結果

結合正交試驗的分析結果以及單因素試驗結果可知，柿葉單寧提取率影響因素的主次順序為料液比、提取溫度、提取時間，柿葉單寧的最優提取工藝：在100 ℃下提取1.0 h，料液比為1∶30，提取次數為3次。

2.4 驗證性試驗

在最優提取條件下進行3次平行試驗，單寧平均質量分數達到27.43 mg/g，出膏率為16.57%，證明了結果的可靠性。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度

精確吸取質量濃度為0.025 3 mg/mL的標準品溶液 1.0 mL，按2.1.3的方法操作，在765 nm下連續測定6次吸光度，結果依次為0.374、0.374、0.374、0.374、0.375、0.375，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.14%，表明該儀器精密度良好。

2.5.2 重復性

在100 ℃條件下，以1∶30的料液比提取1 g干燥落柿葉 1.0 h，平行提取6次，按2.1.3的方法操作，在765 nm下測定，計算單寧的平均質量分數為13.31 mg/g，RSD為1.90%。

2.5.3 穩定性

取干燥落柿葉的提取液1.0 mL（制備方法見2.1.4），室溫下分別放置0、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h后，按2.1.3的方法操作，在765 nm下測定吸光度，結果依次為0.633、0.633、0.635、0.635、0.636、0.638，RSD為0.30%，表明提取液在 6.0 h內的穩定性良好。

2.5.4 加樣回收率

精確吸取已知質量濃度的提取液，隨后加入沒食子酸對照品溶液，按2.1.3的方法操作測定吸光度，按公式“加樣回收率=（測得量-原質量）/加樣量×100%”計算加樣回收率，結果如表3所示。由表3可知，加樣回收率均在95.00%～105.00%，可見該方法的系統誤差較小。

表3 加樣回收率試驗結果

3 討論

柿葉中的單寧具有抗氧化、抗衰老等作用，常被用于美容制品中，柿葉中單寧的提取率直接影響美容制劑的使用效果。本研究通過單因素試驗及正交試驗探討了柿葉單寧的提取工藝，結果發現，柿葉單寧提取率的影響因素主次順序為料液比、提取溫度、提取時間。其中，提取時間并非越長越好，在長時間的高溫下進行提取，柿葉中的單寧成分會發生一些不可逆的化學反應，例如氧化、降解等。基于這一點，可以通過增加提取次數來提高單寧的提取率。

在對單寧質量分數進行測定時，顯色時間以及顯色溫度對最后結果的影響較大，因此，要嚴格控制顯色條件，使結果更加準確。

在本試驗的最優提取條件下，單寧平均質量分數達到27.43 mg/g，出膏率為16.57%，高于其他多數研究中的單寧提取率[5-8]。

綜上所述，本試驗的提取方法操作簡單便利、提取率高，有利于將來對柿葉單寧的研究以及開發利用。