納米多孔金電化學傳感器構建及其對飲品中 抗壞血酸的檢測

張巧云，程瑋瑋，張 巖，楊文建，楊玉玲，湯曉智,

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及 深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050091）

抗壞血酸，又稱VC，是人體必需的一種水溶性維生素，廣泛存在于新鮮水果和綠葉蔬菜中，尤其是蕃茄、橙、橘、鮮棗和辣椒中含量最多[1]。它是人體必需的營養素之一，是人體生命活動中酶輔因子和酶的重要組成部分[2]。VC廣泛參與機體氧化、還原等復雜代謝過程，能促進體內膠原蛋白和多糖的合成，增加機體抵抗力，延緩衰老，預防壞血病及癌癥[3]。在人體內的新陳代謝過程中，VC可調節機體代謝，增加機體抵抗力；它在人體內的協同作用，可以有效提高人體對鐵的吸收率，從而促進外傷愈合[4]。但是，由于機體內缺少合成VC必需的古洛糖內酯氧化酶，人體自身不能合成VC，須從食物中獲取，所以食品中VC也是食品貯藏、加工過程中的一項重要營養指標。VC每日推薦攝入量為70～90 mg，每日的安全劑量應少于1 000 mg，過量攝入時也會引起胃酸、腹瀉及尿酸結石及皮疹等不良反應[5]。在食品加工中，VC常作為一種營養強化劑被添加到飲料、肉制品及保健品中。同時，由于其具有強還原性，還可作為抗氧化劑使用，對食品起到一定的保鮮作用。鑒于VC在食品中的廣泛應用，人們對其含量的定量檢測一直非常重視。但是，由于VC易被空氣中的氧氣氧化，且易受溫度、金屬離子、pH值、酶、食品的加工貯存方式等影響，導致許多VC檢測方法的測定并不精確。在實際檢測中，如何對抗壞血酸快速、精確定量是目前面臨的一項重要挑戰[6]。

目前，VC測定方法主要有高效液相色譜法、超高液相色譜-串聯質譜法、電化學法、光譜法、動力學光度法、熒光法等[7-15]。但是由于光譜法、色譜法及質譜法等幾種分析方法存在儀器價格高、光路復雜、運行費用高、不易攜帶等缺點，不適用于現場檢測。在實際樣品檢測中，VC遇氧、熱、光、堿性物質，特別是在有氧化酶及痕量銅等金屬離子存在時，易被氧化成為脫氫型VC，所以復雜的前處理過程會對檢測結果的準確性造成嚴重影響。電化學檢測作為一種快檢技術，近幾年來，其應用的領域正在不斷擴大，除了在生物醫藥、環境監測等領域，在食品安全檢測上的運用也越來越廣泛。電化學分析法具有良好的選擇性、輕便的儀器設備和快速的分析速度，對于一些樣品，甚至不需要前處理過程。利用一些化學物質、生物材料修飾電極，通過構建的電化學傳感器將化學信號轉變為電信號，能檢測到特定目標物質，方法簡便、重復性強，適合現場快速檢測。近幾年，由于納米材料的興起，采用納米材料修飾或聚合物復合碳納米材料修飾電極測定VC的研究時有報 道[16-20]。但是，多種材料復合修飾，電極的制備過程往往較為繁瑣，導致電極制備存在嚴重的批次間差異，這也限制了它們在實際檢測中的廣泛運用。

納米多孔金（nanoporous gold，NPG）作為一種納米材料，易于制造，具有高電化學催化作用、高比表面積、出色的化學穩定性，因此在電化學領域及各類傳感器中應用廣泛[21]。其獨特的三維網狀結構和納米級孔隙率增加了比表面積，有利于吸附更多的檢測目標物并對其進行高靈敏度檢測[22]。

本研究采用NPG修飾玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE），成功構建NPG電化學傳感器，可對VC進行快速檢測。本研究結果有望為實現飲料中VC的快速精確檢測提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水溶C100飲品、農夫果園果汁 南京市蘇果超市購。

VC標準品（L-VC，純度（99.9±0.5）%） 上海 源葉生物科技有限公司；偏磷酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、硝酸（質量分數約為65%）（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；5%的Nafion溶液 昆山桑萊特新能源科技有限公司； 實驗所用其他試劑均為分析純。

磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）：稱取適量磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合配制而成；檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）：稱取檸檬酸和檸檬酸鈉混合配制而成；0.5 mol/L H2SO4溶液：將13.587 mL濃H2SO4稀釋于500 mL超純水中配制而成；12 K Au/Ag金箔（Au50%、Ag50%） 美國Sepp Gilding Workshop公司；氧化鋁粉（50 nm） 上海辰華儀器公司；高純氮氣（純度＞99.9%）；0.5% Nafion溶液：稱取1 g 5%的Nafion溶液于9 g無水乙醇中配制而成；實驗中清洗、配制溶液等均使用超純水：電阻率≥18 MΩ?cm。

1.2 儀器與設備

電極反應池由山東大學化學院玻璃儀器制造室訂制；GCE（直徑5 mm）、Pt片電極（長×寬1 cm×1 cm）、CHI 150飽和甘汞電極（saturated calomel electrode，SCE） 天津艾達恒晟科技發展有限公司；CHI 760D電化學工作站 上海辰華儀器公司；ISO 9001電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司； 紅外干燥箱 南京科爾儀器設備有限公司；PHS-25雷磁 pH計 上海力辰儀器科技有限公司；場發射掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 NPG的制備

NPG的腐蝕：采用去合金法[23]，通過濃硝酸腐蝕12 K Au/Ag金箔可制得NPG。首先將合金箔裁剪成0.8 cm×0.8 cm大小，并轉移到已預熱10 min的濃硝酸中，30 ℃水浴30 min；水浴后撈出金箔轉移到超純水中，靜置10 min；將金箔轉移至另一杯超純水中靜置30 min；重復該步驟，直至移出金箔的超純水pH值呈中性[24-26]，浮純水中的金色薄膜即NPG。

1.3.2 NPG電化學傳感器的構建

GCE的清洗：少量氧化鋁粉（0.05 μm）置于麂皮上，將GCE拋光至鏡面，沖洗干凈后在超純水中超聲清洗10 min，徹底洗去氧化鋁粉后，在50%硝酸溶液中超聲清洗5 min。再用無水乙醇、超純水交替超聲3 min，超純水沖洗干凈后，自然晾干電極表面。然后，在電極表面滴加5 μL 0.5% Nafion溶液，防塵櫥中自然晾干后電極表面形成一層Nafion膜；再將電極浸入水中，將漂浮在水中的NPG平貼在電極表面，取出擦除電極上的水珠和玻碳周邊多余的金漬；最后，在鏡片邊緣滴加Nafion覆蓋金箔，防塵櫥中自然晾干后，紅外干燥10 min，即制得NPG/GCE，將制備好的NPG/GCE放入防塵櫥中備用。

1.3.3 NPG電化學傳感器的表征

為表征NPG的表觀形貌，將超純水中的NPG貼附在導電膠上紅外干燥10 min，置于S-4800掃描電子顯微鏡下觀察。考慮到NPG是由金銀合金箔經硝酸腐蝕制成，因此，銀元素殘留會大大影響多孔金的結構及電極性質。為評估NPG的化學純度并評估是否存在其他污染物，同時對其EDS能譜進行掃描。

1.3.4 NPG電化學傳感器的活化及電化學測試

裸GCE的電子轉移速率較低，電化學性能較差，通過電化學方法對電極進行活化[27-28]，能激活電極表面NPG性能，提升電荷傳遞能力，從而充分發揮NPG/GCE的功效。將制備好的NPG/GCE轉移到15 mL 0.5 mol/L H2SO4中用循環伏安（cyclic voltammetry，CV）法掃描，使NPG初步活化；然后，將NPG/GCE用超純水洗去H2SO4，轉移到磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）中，再次進行CV掃描，這不僅清洗了電極表面，而且使NPG/GCE得到進一步活化。

以還原峰峰電流表征NPG/GCE的有效面積 （s/cm2＝Ah/C×2 500，其中，Ah為電荷量）和電流密度j=i/s（i為峰電流值）。實驗中所有電化學反應均利用傳統三電極體系在室溫（約25 ℃）進行，以NPG/GCE作為工作電極，表面積2 cm2的Pt片電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。在所有實驗前的15 min向體系內通高純氮氣以除去溶液中的氧氣，實驗過程中持續通入氮氣，排除氧氣防止VC被氧化。使用CHI 760E電化學工作站進行測試，工作原理如圖1所示，所有電位均相對于SCE。

圖1 工作原理Fig. 1 Schematic diagram of the working principle of the NPG-based electrochemical sensor

1.3.5 VC的電化學檢測

準確稱取5 mg VC標準品，配制成5 mg/mL VC母液，通過向含有15 mL檸檬酸緩沖液的電解池中加入不同體積的母液，利用差分脈沖伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法，得到不同的峰電流值，以VC質量濃度為橫坐標，峰電流值為縱坐標，建立標準曲線。

1.3.6 樣品處理

選取水溶C100和農夫果園果汁2 種飲料，準確移取20 μL，將其稀釋100 倍后經過0.45 nm過濾得到濾液，取500 μL樣品濾液于電解池中，測定樣品的VC峰電流值。每個樣品重復測定3 次取平均值。

2 結果與分析

2.1 NPG的表征

由圖2a、b可以清晰看到，NPG表面有密集的孔洞，這是Au/Ag金箔中的Ag被硝酸腐蝕后留下的納米孔洞；由NPG的EDS能譜圖（圖2c）可見，在2.12 keV出現明顯的Au強度值，表明富含Au元素；同時，含有少量O和C元素，沒有出現明顯的Ag元素，證明合金中的Ag被腐蝕完全，制得的NPG具有高純度。

圖2 NPG的形貌表征Fig. 2 Morphological characterization of NPG

2.2 電化學檢測條件優化

2.2.1 緩沖液的優化

NPG具有強催化性能和強吸附作用，結合VC的氧化機理（C6H8O6－2H+→C6H6O6+2e）可知，在實驗中，VC分子均勻分散于NPG中，再經過NPG催化，羥基基團上的氫被氧化，產生了2 個電子。因此，NPG活性對VC有一定的影響。利用CV法，在掃描速率為50 mV/s條件下，研究NPG的電極在不同緩沖溶液（50 mmol/L）中的電化學活性。如圖3所示，在相同pH值條件下，不同緩沖液中氧化還原峰的位置基本不變，對比峰高，可以明顯看到在檸檬酸緩沖液中（50 mmol/L、pH 6.0），NPG/GCE的氧化還原峰電流密度明顯高于磷酸緩沖液和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，表明在檸檬酸緩沖液中，NPG的催化性能被激活到最大，有利于進一步催化VC產生電子。因此，后面選用檸檬酸緩沖液體系作為VC的檢測環境。

圖3 NPG/GCE在3 種不同緩沖液中的CV圖（pH 6.0）Fig. 3 Cyclic voltammograms (pH 6.0) of NPG/GCE in three different buffers

2.2.2 pH值條件的優化

對于同一種緩沖液，電解液的pH值可能會對電極表面的動力學以及電荷轉移有很大影響。有文獻[29]報道：由于H+參與了VC的氧化過程，所以隨著pH值的變化，VC的氧化峰電位會發生偏移且峰電流呈減小趨勢。因此，電解液的最適pH值也是電化學分析技術的重要參數。由于VC在堿性條件下更容易氧化分解，所以選用偏酸性的pH 3.0～6.0的檸檬酸緩沖液對VC檢測條件進行優化。

為更好地實現對VC的高靈敏度檢測，分別考察構建的NPG/GCE在不同pH值條件下（3.0～6.0）對同一質量濃度的VC（160 μg/mL）的電化學響應，對電解液的最適pH值進行優化。如圖4所示，隨著緩沖液pH值的升高，NPG對VC的電化學催化氧化的峰電流密度先升高后降低，且伴隨著出峰電位的變化。當pH值為4.0時，電極對VC催化所產生的峰電流密度達到最高，即獲得高峰值電流響應；在較低pH值和較高pH值條件下，氧化還原峰電位分別朝著正方向和負方向移動；pH值大于4.0時，VC的峰值電流之所以隨著pH值的增加而降低，可能是由于較高pH值下VC的分解所致，這些現象表明pH 4.0的檸檬酸緩沖液體系更加有利于VC的氧化。因此，在該工作中選擇pH 4.0的檸檬酸緩沖液對目標分析物VC進行進一步研究。

圖4 NPG/GCE在不同pH值含160 μg/mL VC檸檬酸緩沖液中的DPV曲線Fig. 4 DPV curves of NPG/GCE in CBS buffer containing 160 μg/mL VC at different pH

根據前人的研究[30-32]和實驗探索，對VC電化學檢測的分析方法進行優化，結果表明相比較于CV法、線性掃描伏安法、方波伏安法等分析方法，在同一VC質量濃度下，采用DPV法出峰更加明顯，能更好地實現VC的靈敏性檢測。因此，本研究采用DPV法，在檸檬酸緩沖體系下，對不同質量濃度下的VC標準品進行檢測，通過相關性分析建立模型，并將其用于飲料中VC含量的快速測定。

2.2.3 反應類型的判斷

NPG/GCE在除去氧氣的檸檬酸緩沖液（50 mmol/L， pH 4.0）中進行掃描速率實驗，如圖5所示，在不同的掃描速率下，發現電流密度的大小取決于掃描速率。對掃描速率的1/2次方與峰電流密度進行擬合，在20～200 mV/s的范圍內，掃描速率的1/2次方與峰電流密度呈線性關系，線性方程為j=16.406 1v1/2－2.445 1，R2=0.997 7。陰極電流密度和陽極峰電流密度之比 接近1。這些典型特征與文獻[33-35]的掃描速率實驗結果吻合，證實在本實驗中，電子在NPG電極表面轉移的過程是擴散控制的過程。

圖5 不同掃描速率下，NPG/GCE在含160 μg/mL VC檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 4.0）中的CV曲線Fig. 5 CV curves of NPG/GCE in CBS buffer (50 mmol/L, pH 4.0) containing 160 μg/mL ascorbic acid at different scanning rates

2.2.4 NPG電極的重復性及貯存穩定性

由于電極的使用次數及保存時間會影響電化學峰電流的測定。在實際檢測中，為保證實驗的準確性，需要對修飾電極的重復性和穩定性進行考察。在含有一定質量濃度VC標準液的反應體系中進行4 次連續測試，對修飾多孔金電極的重復性進行研究，經計算4 次測試相應峰電流密度，得到相對標準偏差為2.47%，說明電極幾乎不會被污染，有良好的重復性。

在最佳條件下（pH 4.0檸檬酸緩沖液中），通過DPV法對所制備的電化學傳感器的貯存穩定性進行研究。NPG/GCE存于超純水中，于4 ℃貯存1 個月，連續4 周觀察電極在含有100 μg/mL VC檸檬酸緩沖液中的響應電流密度變化。如圖6所示，前4 周響應電流變化不大，表明電極有較長的使用壽命和穩定性。在10 周后觀察到電流響應有一定損失，這可以歸因于貯存時間過長，NPG表面的緩慢氧化，該變化抑制了VC電子轉移過程，從而導致VC氧化峰電流明顯下降。

圖6 NPG/GCE貯存穩定性檢測的DPV圖Fig. 6 DPV curves of storage stability test of NPG/GCE

2.2.5 NPG/GCE對VC的檢測

VC具有電催化活性，利用DPV法對不同質量濃度VC進行電催化，并觀察電流響應。由圖7可知，NPG/GCE對VC的檢測，在0.1 V處產生明顯的（氧化）峰電流變化，且在6.652 8～160 μg/mL的范圍內，峰電流密度j（μA/cm2）與VC質量濃度CVC（μg/mL）呈線性關系。線性回歸方程為j＝0.765 26CVC+27.899 27，R2＝0.994。

圖7 NPG/GCE在含不同質量濃度VC檸檬酸緩沖液（50 mmol/L， pH 4.0）中的DPV曲線 Fig. 7 DPV curves of NPG/GCE in CBS buffer solution (50 mmol/L, pH 4.0) containing ascorbic acid at different concentrations

2.2.6 NPG/GCE的抗干擾能力測試

食品基質相對較復雜，在實際檢測中，電極的抗干擾能力尤為重要。根據前人[36-39]在電極抗干擾能力研究上的相關經驗，以158 μg/mL的VC標準樣品為試樣，選取飲料配料中常見的葡萄糖、檸檬酸和一些食品添加劑為干擾物質，考察NPG/GCE的抗干擾能力。將 2 252 μg/mL葡萄糖、288 μg/mL檸檬酸、588 μg/mL檸檬酸鈉、230 μg/mL羧甲基纖維素鈉、0.36 μg/mL胭脂紅分別加入到含有900 μmol/L VC的檸檬酸緩沖液（pH 4.0）中，觀察了DPV的峰電流密度隨定量添加干擾物后的變化行為。如圖8所示，這些飲料中的成分被加入到反應體系中后，NPG電極檢測VC的峰電位和峰電流密度均無明顯變化。其中，VC的峰電流密度變化率均小于3.7%。因此，構建的NPG電極在檢測VC時，對飲料中常見組分具有較好的抗干擾能力。

圖8 飲料中常見干擾物質對NPG/GCE檢測VC的影響Fig. 8 Effects of common interfering substances on VC detection by NPG/GCE in beverages

2.2.7 NPG/GCE對實際樣品VC的測試

采用加標回收法對電極的實用性能進行評估，利用NPG/GCE對水溶C100和農夫果園兩種飲料中的VC質量濃度進行檢測。為確保實驗的準確性，在pH 4.0檸檬酸緩沖液中加入450 μL樣品的同時加入一定質量濃度的VC，將NPG/GCE檢測得到的數值代入相應擬合曲線（j=0.765 26CVC+ 27.899 2）計算加入樣品中VC質量濃度，結果如表1所示，結果表明VC回收率在94%～109%之間。基于以上結果，證實利用NPG/GCE可以有效地對實際樣品中VC進行檢測，檢測結果具有可靠性。同時將電化學檢測結果與高效液相色譜法進行比較，結果如表2所示，2 種測定方法的結果具有較好的一致性，結果令人滿意，證明該NPG傳感器具有很好的實用性。

表1 飲料中VC的測定結果Table 1 Recoveries of VC in spiked beverages

表2 不同檢測方法對水溶C100中VC含量測定結果的對比Table 2 Comparison of HPLC and electronchemistrical methods for detection of VC content in water-soluble C100

3 結 論

本實驗利用腐蝕法制備NPG，并將其應用于構建一種基于NPG的電化學傳感器，用于飲料樣品中VC的快速檢測。NPG獨特的三維網狀結構，使修飾電極對VC具有較強的吸附性和良好的電催化能力，提高了VC響應電流的能力，可用于VC的定量檢測。在一定質量濃度范圍的VC溶液中，峰值電流與掃描速率呈線性關系，說明NPG對VC的電催化受吸附效應控制。當VC質量濃度介于6.652 8～160 μg/mL時，其氧化峰電流密度與質量濃度具有良好的線性關系。該檢測方法電極制備簡單，無需對樣品進行復雜前處理，有效避免了VC的氧化，檢測結果更加準確，檢測更加迅速。小型檢測設備便于攜帶，可以滿足食品質檢中對樣品現場快速檢測的需求。