改進的QuEChERS-氣相色譜-質譜法測定中式臘肉中8 種揮發性N-亞硝胺

戴裕杰，關榮發,，黃海智，孫玉敬，何榮軍，楊 開，蔡 銘

（1.中國計量大學生命科學學院，浙江 杭州 310018；2.浙江工業大學食品科學與工程學院，浙江 杭州 310014）

作為N-亞硝基化合物中的一類，目前已知的N-亞硝胺約有300 種，其基本結構為R1(R2)N—N＝O，且大部分具有致癌性。N-亞硝胺廣泛存在于飲料和酒類[1-2]、醬油[3]、 蔬菜制品[4-6]、水產品[7-9]、肉及肉制品[10-11]等食品中。食品中的N-亞硝胺可分為揮發性N-亞硝胺和非揮發性 N-亞硝胺兩類，而揮發性N-亞硝胺的致癌作用強于非揮發性N-亞硝胺[12]。食品中常見的揮發性N-亞硝胺包括 N-亞硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亞硝基甲乙胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亞硝基二丙胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基二丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）等。1987年國際癌癥研究機構將N-亞硝胺定義為強致癌性食品污染物，并將NDMA和NDEA列為2A類致癌物[13]。

中式臘肉是一種以畜肉為原料，配以其他輔料，經腌制、烘干（或曬干、風干）、煙熏（或不煙熏）等工藝加工而成的非即食肉制品[14]。煙熏臘肉主要在四川和湖南生產消費[15-16]，因其獨特的風味和易于保存的特性而深受當地居民的喜愛。在臘肉腌制過程中常會加入亞硝酸鹽，以起到發色、抗氧化和抑菌的作用[17]，進而提高產品的食用品質和生物安全性。但在臘肉加工和后續貯藏過程中，特別是在酸性條件下，亞硝酸鹽會和蛋白質分解產生的仲胺通過亞硝化反應生成N-亞硝胺[18]。此外，以豬肉這類紅肉作為制作原料[11,19]以及采用烘烤煙熏的熱加工方式[20-21]都會提高臘肉中N-亞硝胺的含量水平。臘肉中N-亞硝胺的存在，嚴重影響其食用安全性并對公眾健康安全構成威脅。GB 2762—2017《食品中污染物限量》要求肉制品中NDMA含量應不大于3.0 μg/kg[22]；而美國農業部規定腌制肉類中總揮發性N-亞硝胺的限量標準為10.0 μg/kg。目前，尚未有研究報道中式臘肉中N-亞硝胺的風險水平，因而有必要對代表性產地中式臘肉中N-亞硝胺的種類和含量進行檢測并評估其風險水平。

QuEChERS方法通過使用萃取鹽和吸附劑將前處理中的提取和凈化相結合，相比固相萃取[23-24]和固相微萃取[11,25]無需專用設備，具有簡便、廉價的特點。該方法目前已在部分動物性食品中N-亞硝胺檢測的前處理環節使用[8,10,26-27]，但尚未用于中式臘肉。此外，臘肉中N-亞硝胺含量低，且基質復雜（含脂肪、煙熏和香辛料等成分），因此需基于QuEChERS法對前處理中的提取、凈化和濃縮環節進行系統優化。目前，色譜-質譜聯用技術憑借其出色的分離能力和高靈敏度已廣泛應用于食品中N-亞硝胺的檢測[1,6,11]。綜合儀器的靈敏度和通用性，本研究采用GB 5009.26—2016《食品中N-亞硝胺類化合物的測定》第1法中的氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法[28]進行分離定量。

本研究旨在采用改進的QuEChERS和GC-MS法建立測定中式臘肉中8 種揮發性N-亞硝胺（包括NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR和NMOR，化學結構見圖1）的檢測方法。系統優化提取溶劑種類、超聲時間、冷凍時間、吸附劑種類和用量、氮吹水浴溫度以及氮吹定容體積，并從線性關系、基質效應、靈敏度、準確度和精密度方面對方法進行評價。同時，應用該方法檢測12 份代表性市售樣品，評估目前中式臘肉中N-亞硝胺的風險水平，并分析產地和豬肉種類對N-亞硝胺含量影響的顯著性。以期能為臘肉及其他肉制品中N-亞硝胺的控制工藝研發、風險評估和法規完善提供方法支持和數據借鑒。

圖1 8 種揮發性N-亞硝胺的化學結構式Fig. 1 Chemical structures of eight volatile N-nitrosamines

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

12 份代表性中式臘肉樣品（四川和湖南各6 份）均購自電商平臺；通過預實驗選擇基質最復雜的7號中式臘肉（豬五花）樣品作為前處理優化和方法評價中的實驗基質，計算回收率時扣除其N-亞硝胺本底含量。

乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯化鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉（均為分析純） 杭州高晶精細化工有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（octadecylsilane，C18） 上海安譜實驗科技股份有限公司；甲殼素、殼聚糖、多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）、納米Fe3O4上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-亞硝胺混標（2 mg/mL，含NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR和NMOR） 美國o2si公司。

1.2 儀器與設備

BCD-215YD E冰箱 青島海爾股份有限公司；PL403電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司； NP-30旋渦混合器 常州恩培儀器制造有限公司； KQ-100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DW-FW251超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技有限責任公司；Allegra X-30R高速冷凍離心機 美國 Beckman Coulter公司；7890A-5975C GC-MS聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 提取

將樣品去皮后切成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉丁，混勻后－20 ℃冷凍3 h以上。取適量樣品放入粉碎機中絞碎，稱取10 g（精確至0.01 g）試樣至50 mL聚丙烯離心管中。加入10 mL乙腈，渦旋10 s混勻；再加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，渦旋10 s、振蕩5 s混勻；30 ℃超聲波輔助提取10 min。

1.3.1.2 凈化

－40 ℃冷凍20 min后，0 ℃、8 000 r/min離心10 min。將上清液轉移至另一含300 mg PSA和900 mg無水硫酸鈉的50 mL離心管中，渦旋1 min后，0 ℃、8 000 r/min離心10 min。

1.3.1.3 濃縮

將上清液轉移至另一50 mL離心管中，30 ℃水浴氮吹至約1 mL。將濃縮液移取至濃縮管中，室溫氮吹至300 μL。用1 mL注射器吸取樣液，過0.22 μm尼龍濾膜后注入含內插管的進樣瓶中，－20 ℃保存待測。

1.3.2 標準溶液的配制

混標儲備液（1 000 ng/mL）的配制：準確移取25 μL混標原液于50 mL容量瓶，乙腈定容。

溶劑混標工作液的配制：用乙腈將混標儲備液逐級稀釋，配制成質量濃度分別為5、10、15、20、50、150、500 ng/mL的溶劑混標工作液。

基質混標工作液的配制：取7號樣品按1.3.1.1節和1.3.1.2節處理，將上清液轉移至50 mL離心管，30 ℃水浴完全氮吹干后分別加入300 μL 5、10、20、50、150 ng/mL 和500 ng/mL的溶劑混標工作液，渦旋混勻。

上述標液均置于－20 ℃保存。

1.3.3 GC-MS條件

參考相關文獻[27,29]方法進行分析。DB-WAX極性毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm）；程序升溫：初始溫度50 ℃，以20 ℃/min升至120 ℃，再以5 ℃/min升至200 ℃，最后以20 ℃/min升至240 ℃；進樣口溫度240 ℃；載氣（氦氣）流速1.0 mL/min；不分流進樣；進樣量2 μL。

電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；采用選擇離子監測模式。8 種揮發性N-亞硝胺的保留時間和質譜參數見表1，色譜圖見圖2。

圖2 8 種揮發性N-亞硝胺標準品色譜圖（500 ng/mL）Fig. 2 Chromatograms of a mixture of eight volatile N-nitrosamine standards (500 ng/mL)

表1 8 種揮發性N-亞硝胺的保留時間和質譜參數Table 1 Retention time and mass spectrometric parameters for eight volatile N-nitrosamines

1.4 統計分析

利用Excel 2019軟件進行數據處理，利用GraphPad Prism 8軟件進行作圖和統計分析。實驗設置3 個重復，結果以±s表示。分別采用單因素方差分析Tukey檢驗和獨立樣本t檢驗確定多組和2 組數據均值間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 前處理優化

2.1.1 提取溶劑種類和超聲時間

提取不同動物性食品基質中N-亞硝胺實驗確定的最佳提取溶劑有所不同[9,24,29]。因此，本實驗綜合采用5 種不同極性的溶劑（乙腈、甲醇、正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯）對加標樣品中8 種不同極性的N-亞硝胺[30]進行提取。樣品按1.3.1.1節提取，加入不同溶劑前均勻滴加200 μL 500 ng/mL的溶劑混標工作液并室溫靜置15 min[10]進行加標處理（后續加標方式同此），其中超聲提取0 min；并按1.3.1.2節凈化，其中－40 ℃冷凍10 min，僅使用900 mg無水硫酸鈉作為凈化填料。將提取凈化后的樣液50 ℃水浴充分氮吹，上述溶劑對應的共提取雜質體積分別約為0.2、0.5、1.0、1.4 mL和1.8 mL。可見正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯這3 種親油性溶劑對高脂肪食品中油脂的溶解性較高[24,27]。為降低后續凈化難度同時滿足500 μL以下氮吹定容體積的要求，因此選擇乙腈作為提取溶劑（圖3a）。此外，Qiu Yuesheng[8]和Dong Hao[9]等的研究結果表明，采用乙腈提取N-亞硝胺相比其他溶劑具有更高的回收率。

圖3 提取條件對8 種揮發性N-亞硝胺回收率的影響Fig. 3 Effect of extraction conditions on recoveries of eight volatile N-nitrosamines

而陶森等[29]的實驗結果表明，乙酸乙酯（96.3%）相比乙腈（87.4%）對NDMA的提取回收率更高。為進一步提高8 種N-亞硝胺的回收率，采用乙腈結合超聲波輔助提取。加標樣品按1.3.1.1節提取，超聲提取不同時間（0、10 min和20 min）；凈化處理同提取溶劑種類優化；按1.3.1.3節濃縮，其中水浴溫度50 ℃、氮吹濃縮至500 μL。如圖3b所示，超聲提取10 min相比不處理（0 min），5 種N-亞硝胺（除NDBA、NPIP和NMOR）的回收率均有顯著提高（P＜0.05）。而隨著超聲時間延長到20 min，部分小分子質量、低沸點的N-亞硝胺（NDMA、NMEA、NDEA和NDPA）的回收率相比10 min出現顯著下降（P＜0.05），這可能是萃取鹽進一步吸水放熱和超聲提取熱效應造成的損失。因此，選擇超聲提取時間為10 min。

2.1.2 冷凍時間、吸附劑種類和用量

中式臘肉中脂肪含量較高，尤其是以豬五花肉為原料制作的臘肉。雖然采用乙腈提取能夠明顯減少脂肪類共萃取物，但提取液中仍會保留少量的脂類物質。提取液經氮吹濃縮，其中雜質的比例會進一步提高，從而影響結果定量的準確性。根據脂類在低溫下易凝固的特性及其與N-亞硝胺熔點的差異，可利用冷凍和低溫離心的方法使脂肪從提取液中析出并與之分離[13,29]。加標樣品按1.3.1.1節提取；按1.3.1.2節凈化，分別冷凍不同時間（0、10、20 min和30 min），其中僅使用900 mg無水硫酸鈉作為凈化填料；濃縮處理同超聲時間優化。隨著冷凍時間的延長，除脂效果會更加徹底，但當時間延長至30 min，NMOR的回收率出現顯著下降（P＜0.05） （圖4）。因此，確定最佳冷凍時間為20 min。

圖4 冷凍時間對8 種揮發性N-亞硝胺回收率的影響Fig. 4 Effect of freezing time on recoveries of eight volatile N-nitrosamines

冷凍凈化后的上清液呈淡黃綠色，將其充分氮吹，離心管底部仍有微量紅色油狀雜質。本實驗分別采用6 種不同除雜效果的吸附劑（PSA[3,27]、C18[3,26]、甲殼 素[31-33]、殼聚糖[32-33]、MWCNTs[34-35]和納米Fe3O4[36]）結合無水硫酸鈉作為QuEChERS凈化填料進行第2步凈化。樣品按1.3.1.1節提取；按1.3.1.2節凈化，其中凈化填料分別采用6 種不同吸附劑+900 mg無水硫酸鈉的形式。在200、300 mg和400 mg添加量條件下，提取液經PSA凈化并充分氮吹后離心管底部無明顯油狀物殘留，其凈化效果均明顯優于其他5 種吸附劑。這可能是由于經冷凍凈化后提取液中保留的主要是少量極性共萃取物，它們更易通過極性相互作用與PSA結合。在已加入PSA的50 mL離心管中添加10 mL 10 ng/mL的溶劑混標工作液，渦旋1 min后0 ℃、8 000 r/min離心10 min，濃縮處理同超聲時間優化，考察不同PSA用量（200、300 mg和400 mg）對8 種N-亞硝胺回收率的影響。由表2可知，當用量增加到400 mg時，NDMA、NDBA和NPYR的回收率均出現顯著下降（P＜0.05），因而選擇300 mg作為PSA的最終用量。在此基礎上，確定凈化填料的最佳組合為300 mg PSA+900 mg無水硫酸鈉。

表2 吸附劑種類和用量對8 種揮發性N-亞硝胺回收率的影響Table 2 Effects of adsorbent types and amounts on recoveries of eight volatile N-nitrosamines

2.1.3 氮吹水浴溫度和氮吹定容體積

8 種N-亞硝胺為低分子質量、易揮發性物質，根據超聲提取溫度實驗結果（該因素未列出），其回收率易受溫度影響。取10 mL 10 ng/mL溶劑混標工作液按1.3.1.3節濃縮至500 μL，考察不同水浴溫度（30、40、50、60 ℃和70 ℃）對8 種N-亞硝胺回收率的影響。如圖5a所示，當水浴溫度從30 ℃升至40 ℃，NDMA、NMEA和NDEA 3 種N-亞硝胺的回收率出現顯著下降 （P＜0.05）。為保證小分子質量N-亞硝胺的回收率，最終采用30 ℃的氮吹水浴溫度。

圖5 濃縮條件對8 種揮發性N-亞硝胺回收率的影響Fig. 5 Effects of condensation conditions on recoveries of eight volatile N-nitrosamines

為提高方法的靈敏度，需將樣液濃縮至微量體積。取10 mL 10 ng/mL溶劑混標工作液按1.3.1.3節氮吹濃縮至不同體積（0、100、300 μL和500 μL）。如圖5b所示，當采用完全吹干（0 μL）后加對應體積溶劑的定容方式時，會造成8 種N-亞硝胺回收率的顯著下降 （P＜0.05），這與Dong Hao等[9]的研究結果一致。而選擇氮吹至近干后定容的方式，在微量定容體積條件下會使結果產生較大偏差。因而選擇先將樣液水浴氮吹至約1 mL再轉移至濃縮管常溫氮吹至對應定容體積的方式進行濃縮。分別考察濃縮至100、300 μL和500 μL對8 種N-亞硝胺回收率的影響，結果表明當氮吹濃縮至300 μL時8 種N-亞硝胺的回收率相較500 μL無顯著下降，同時能在一定程度上降低方法的定量限。而當濃縮至100 μL時，由于定容體積過小，無法保證部分N-亞硝胺的回收率。因此，最終選擇將樣液氮吹濃縮至300 μL。

2.2 方法評價

2.2.1 線性關系、基質效應、檢出限和定量限結果

按1.3.3節方法分別對6 個質量濃度梯度（5、10、20、50、150 ng/mL和500 ng/mL）的溶劑和基質混標工作液進行檢測，以質量濃度（ng/mL）為橫坐標、目標物定量離子峰面積為縱坐標進行線性回歸，分別得到相應的線性方程和相關系數。基質和溶劑線性方程的相關系數均大于0.997（表3僅為基質的），表明目標物在相應質量濃度范圍內線性關系良好。

表3 8 種揮發性N-亞硝胺的線性范圍、線性方程、相關系數、 基質效應、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients, matrix effects, limits of detection and limits of quantification for eight volatile N-nitrosamines

通過計算基質與溶劑標準曲線間斜率的比值考察基質效應[8]。根據SANTE文件[37]，當基質效應為0.8～1.2時，表明基質效應較弱，可忽略其對結果的影響。由表3可知，8 種N-亞硝胺的基質效應為0.86～0.98，表現為不同程度的基質抑制，但整體較弱，這表明通過低溫冷凍結合PSA兩步凈化實現了良好的除雜效果。但為獲得更準確的結果，本研究仍采用基質標準曲線對目標物進行校正定量。

分別將定量離子信噪比為3∶1和10∶1時每種目標物的含量定義為該方法的檢出限和定量限。如表3所示，該方法8 種揮發性N-亞硝胺的檢出限和定量限范圍分別為0.05～0.14 μg/kg和0.15～0.47 μg/kg，其定量限水平均低于GB 5009.26—2016《N-亞硝胺類化合物的測定》第一法的定量限（1.0 μg/kg）[28]，這表明方法的靈敏度較高。

2.2.2 平均回收率和相對標準偏差結果

取10 g粉碎后的7號樣品于50 mL離心管中，分別添加200 μL 15、50 ng/mL和150 ng/mL低中高3 個添加量（0.3、1.0 μg/kg和3.0 μg/kg）的溶劑混標工作液進行加標處理。按1.3.1節和1.3.3節進行加標回收實驗，每個添加量設置6 個重復。如表4所示，8 種揮發性N-亞硝胺的平均回收率為71.3%～94.1%，相對標準偏差為0.4%～11.2%，均在SANTE文件規定的可接受范圍內（70%≤平均回收率≤120%、相對標準偏差≤20%）[37]。

表4 8 種揮發性N-亞硝胺的平均回收率和相對標準偏差Table 4 Average recoveries and relative standard deviations of eight volatile N-nitrosamines

2.3 實際樣品測定結果

采用建立的方法對12 份代表性中式臘肉樣品進行檢測，結果如表5所示，中式臘肉中主要的揮發性N-亞硝胺為NDMA、NDEA、NDBA、NPIP、NMEA和NDPA，其檢出率和平均含量分別為41.7%～58.3%和0.33～0.74 μg/kg， 其中NMOR未檢出。目前國標中尚未對總揮發性N-亞硝胺含量進行限定，本研究以樣品中8 種揮發性N-亞硝胺含量之和作為樣品中的總揮發性N-亞硝胺含量。參照GB 2762—2017和美國農業部的限量標準，將單項和總N-亞硝胺的限量水平分別設置為3.0 μg/kg和10.0 μg/kg。12 份樣品中僅1 份樣品的NDEA含量（3.06 μg/kg）超標，而總揮發性N-亞硝胺含量均未超標，這表明目前市售中式臘肉中揮發性N-亞硝胺的含量水平整體較低。這可能與近年來臘肉生產工藝的不斷改進有關，如亞硝酸鹽添加量的控制、衛生狀況的改善和低溫煙熏技術的運用等。此外，由表6可知，產地和豬肉種類對中式臘肉中總揮發性N-亞硝胺含量均未產生顯著影響（P＞0.05）。

表5 12 份中式臘肉樣品中8 種揮發性N-亞硝胺的含量水平Table 5 Contents of eight volatile N-nitrosamines in 12 Chinese bacon samples

表6 產地和豬肉種類對12 份中式臘肉樣品中總揮發性 N-亞硝胺含量的影響Table 6 Effect of geographical origin and pork cuts on contents of total volatile N-nitrosamine in 12 Chinese bacon samples

3 結 論

本研究基于QuEChERS前處理方法進行系統優化。采用冷凍和PSA兩步凈化降低基質效應（0.86～0.98）；通過氮吹濃縮至300 μL提高方法靈敏度（定量限0.15～0.47 μg/kg）；利用乙腈結合超聲波輔助提取提高方法準確度（回收率71.3%～94.1%）。基于改進的QuEChERS法和GC-MS法建立的檢測方法，操作簡便、成本低廉，適用于中式臘肉中8 種揮發性N-亞硝胺的測定。而該法是否適用于其他原料種類的臘肉制品及動物性食品中N-亞硝胺的檢測，則需通過進一步的實驗驗證。該方法的建立有助于為中式臘肉中N-亞硝胺控制技術的研發提供方法支持。

將該方法用于市售樣品中N-亞硝胺水平的評估，結果表明，目前中式臘肉中8 種揮發性N-亞硝胺和總揮發性N-亞硝胺的風險水平均較低。但今后仍需對其風險水平進一步全面評估，包括增大樣本量、擴大原料種類和產地的范圍等。目前國標中僅規定了NDMA的限量要求，但市售樣品中還檢出了其他6 種揮發性N-亞硝胺，因此需增加標準中應檢測的N-亞硝胺種類，尤其是補充總N-亞硝胺含量這一指標。