發(fā)酵時間對半干型發(fā)酵牛肉干品質(zhì)及 蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響

趙改名，焦陽陽，祝超智,，李佳麒，李珊珊，銀 峰，張文華

（1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，河南 鄭州 450002；2.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系中衛(wèi)站，寧夏 中衛(wèi) 750000）

牛肉有高蛋白、低脂肪等顯著優(yōu)勢，因此近年來牛肉制品受到廣大消費者的喜愛[1]。傳統(tǒng)牛肉干制品質(zhì)地較硬，風味單一，不適宜中老年人食用。而半干型牛肉干水分含量高（20%～50%）[2]、嫩度好，可滿足大多數(shù)消費者的需求。發(fā)酵工藝賦予牛肉產(chǎn)品獨特的風味并提高其營養(yǎng)價值[3]，同時降低水分含量、水分活度、抑制食品中病原體（如金黃色葡萄球菌等）的滋生，從而提高食品的安全性[4]。因此，可將發(fā)酵技術(shù)應用于半干型牛肉干的生產(chǎn)，開發(fā)出口感好、有安全保障的新產(chǎn)品。發(fā)酵肉制品常用的發(fā)酵劑主要有酵母菌、霉菌、乳酸菌，其在發(fā)酵肉制品中發(fā)揮獨特的作用，其中乳酸菌至關(guān)重要。乳酸菌發(fā)酵可產(chǎn)生大量乳酸，研究表明[5-7]，乳酸可通過弱化肌原纖維、結(jié)締組織提高肉的嫩度。

目前，關(guān)于發(fā)酵牛肉產(chǎn)品的研究主要集中在優(yōu)勢菌種的篩選、發(fā)酵劑的研發(fā)及相關(guān)產(chǎn)品的工藝優(yōu)化等方面。趙改名等[8]以云南自然發(fā)酵火腿為原料，篩選1 株產(chǎn)酸能力、發(fā)酵特性及對NaCl、NaNO2的耐受性均較好的乳酸菌，其被鑒定為戊糖片球菌。Arief等[9]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可降低牛肉香腸的pH值與水分含量，減緩脂質(zhì)氧化速率，抑制腐敗菌的生長，且延長貨架期。李艷青等[10]對發(fā)酵牛肉香腸的工藝進行優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵工藝條件，其中乳酸菌的最適添加量為106CFU/g，最適溫度為30 ℃，最適發(fā)酵時間為60 h。張金鐸等[11]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌添加量為107CFU/g時，發(fā)酵牛肉串符合各項指標要求。發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的降解，蛋白質(zhì)構(gòu)象也會隨之變化[12]。拉曼光譜技術(shù)具有快速、無損、樣品量少等特點，現(xiàn)已經(jīng)被運用到檢測肉類蛋白結(jié)構(gòu)變化[13]。

本實驗將沙克乳桿菌加入牛肉中分別發(fā)酵0、12、24、36、48、60 h。通過對水分含量、水分分布、pH值、水分活度、剪切力及感官評價指標的測定及電子鼻的主成分分析（principal component analysis，PCA），對不同發(fā)酵時間半干型發(fā)酵牛肉干的品質(zhì)進行比較研究，并采用拉曼光譜技術(shù)研究不同發(fā)酵時間半干型發(fā)酵牛肉干蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，以期為發(fā)酵牛肉產(chǎn)品的開發(fā)與研究提供理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所需牛肉的大黃瓜條部位購于河南伊賽公司；沙克乳桿菌為傳統(tǒng)臘肉中篩選，來自河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點實驗室。

MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責任 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BYXX-50型煙熏箱 中國艾博公司；MODEL2000型沃布剪切力儀 美國G-R公司；SMART System 5水分測量系統(tǒng) 美國CEM公司；35172 BRUZ拍打均質(zhì)機 法國 AES Chemunex公司；HI 99163便攜pH計 德國Hanna公司；AL104電子天平梅特勒 托利多儀器（上海） 有限公司；GHY-3010超級恒溫槽 中國凡帝朗科技公司；PEN3電子鼻 德國Airsense公司；IPC-810B核磁共振成像儀 上海紐邁電子科技有限公司；Raman HR Evolution拉曼光譜儀 法國HORIBA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備工藝流程

將原料肉除去筋膜脂肪，修整為3 cm×1 cm×1 cm塊狀。在修整好的牛肉塊中加入食鹽1.2%、糖1%、葡萄糖1.2%、亞硝酸鈉0.01%、D-異抗壞血酸鈉0.03%，4 ℃腌制24 h。菌液離心后棄去培養(yǎng)基，取離心管菌體沉淀，接種量為107CFU/g，發(fā)酵劑均勻涂抹在樣品表面，25 ℃分別發(fā)酵0、12、24、36、48、60 h。取發(fā)酵后的牛肉，加入等質(zhì)量的清水鹵煮，使用功率3 500 W煮沸后轉(zhuǎn)1 800 W至湯汁收干后即可。將烤盤置于烘箱中，100 ℃烘烤15 min，翻面后70 ℃烘烤35 min，最后取出翻面于70 ℃烘烤20 min。室溫保存以待檢測。

1.3.2 pH值測定

參考GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》[14]。

1.3.3 剪切力測定

參考Li Miaoyun等[15]的方法并略作修改。使用沃布剪切力儀垂直方向切下樣品肌纖維，每組樣品重復測 定5 次。

1.3.4 水分含量測定

將樣品切為碎末狀，置于SMART System 5水分測量系統(tǒng)中測量其水分含量。

1.3.5 水分活度測定

采用水分活度儀進行測定。

1.3.6 水分分布的測定

參考焦陽陽等[16]的方法并略作修改，取2 g樣品，包裹保鮮膜后置于圓柱形玻璃試管底部，每個樣品重復3 次，使用紐邁核磁共振分析應用軟件Ver 4.0軟件對橫向弛豫時間（T2）進行反演。

1.3.7 電子鼻的測定

參考孟舒雨等[17]的方法對實驗樣品進行電子鼻測定。

1.3.8 拉曼光譜測定

將樣品修整為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm塊狀，置于50 倍鏡頭下，調(diào)整好鏡頭與樣品的距離至成像清晰后，對樣品開始掃描，固定波長532 nm，功率衰減片為25%，曝光時間15 s，掃描范圍為400～2 000 cm－1，每個樣品重復3 次。

1.3.9 感官評價

邀請食品專業(yè)20 名學生，按表1對加工后半干型發(fā)酵牛肉干的組織狀態(tài)、色澤、風味、咀嚼性共4 組指標進行評價，每個指標最高分均為25 分。

表1 感官評定標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of semi-dried fermented beef jerky

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析、相關(guān)性分析及PCA，數(shù)據(jù)以±s表示，使用Origin 8.5軟件繪圖。使用Lab Spec 6軟件對拉曼光譜數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對半干型發(fā)酵牛肉干pH值、剪切力、水分活度、水分含量的影響

由圖1A可知，不同發(fā)酵時間的半干型牛肉干pH值差異顯著（P＜0.05），發(fā)酵后的半干型牛肉干pH值均低于未發(fā)酵牛肉干的pH值。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸可降低肉制品的pH值[18]。隨著發(fā)酵時間的延長，pH值逐漸降低，在發(fā)酵60 h時pH值降到5以下。pH值降低可有效抑制食品中的病原體，從而延長其貨架期[19]，因此產(chǎn)酸能力是篩選乳酸菌的重要指標[10]。剪切力可作為肉制品嫩度的判斷依據(jù)[20]，剪切力越小，嫩度越大。不同發(fā)酵時間的半干型牛肉干剪切力差異顯著（P＜0.05），剪切力呈先下降后上升的趨勢（圖1B），其原因可能為發(fā)酵初期pH值下降利于肌原纖維蛋白降解。在一定范圍內(nèi)，pH值越低肌原纖維降解程度越大[21]。卜寧霞[22]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵對組織結(jié)構(gòu)破壞較為嚴重，肌肉纖維結(jié)構(gòu)疏松，甚至出現(xiàn)孔洞，說明微生物發(fā)酵可有效破壞肌纖維結(jié)構(gòu)的結(jié)合性。調(diào)節(jié)pH值引起的蛋白質(zhì)降解及對結(jié)締組織的軟化可改變產(chǎn)品嫩度[23]。但隨著發(fā)酵時間的延長，水分含量與水分活度過低，導致剪切力上升。由圖1C可知，不同發(fā)酵時間的半干型牛肉干水分活度存在顯著差異（P＜0.05），發(fā)酵后半干型牛肉干的水分活度顯著低于未發(fā)酵牛肉干的水分活度，隨著發(fā)酵時間的延長水分活度逐漸降低，其原因為牛肉干經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后pH值降低，蛋白質(zhì)持水能力下降，導致水分活度下降[24]。水分活度降低可抑制腐敗菌的生長，延長其貨架期[25]。由圖1D可知，不同發(fā)酵時間的半干型牛肉干水分含量也存在顯著差異（P＜0.05），發(fā)酵后牛肉干的水分含量顯著低于未發(fā)酵牛肉干的水分含量 （P＜0.05），隨著發(fā)酵時間的延長，水分含量逐漸降低。水分含量的降低有利于水分活度的降低，二者均對產(chǎn)品風味、色澤等感官性狀及產(chǎn)品貨架期具有重要意義[26]。

圖1 發(fā)酵時間對半干型發(fā)酵牛肉干pH值（A）、剪切力（B）、 水分活度（C）、水分含量（D）的影響Fig. 1 Effect of fermentation time on pH (A), shear force (B), water activity (C) and moisture content (D) of semi-dried fermented beef jerky

2.2 不同發(fā)酵時間半干型牛肉干的水分分布

T2可表達肉制品中結(jié)合水、不易流動水、自由水3 種狀態(tài)水分的分布特征[27]，峰比例的變化可反映樣品中3 種狀態(tài)水分子流動轉(zhuǎn)移的情況[28]。由圖2可知，發(fā)酵后的半干型發(fā)酵牛肉干，結(jié)合水的比例顯著增加（P＜0.05）后基本保持穩(wěn)定，不易流動水比例顯著低于不發(fā)酵的半干型牛肉干（P＜0.05）。這說明發(fā)酵使部分不易流動水轉(zhuǎn)化為結(jié)合水，其原因可能為半干型發(fā)酵牛肉干內(nèi)部蛋白質(zhì)變性導致的水分散失及流動性降低。Bertram等[29]研究發(fā)現(xiàn)肌動蛋白變性與肉制品脫水有關(guān)，肉制品中水分的流動性與部分蛋白質(zhì)變性有關(guān)。眾所周知，微生物不能利用結(jié)合水，因此結(jié)合水的比例越大，食品的保存效果越好[30]。

圖2 發(fā)酵時間對水分分布的影響Fig. 2 Effect of fermentation time on water distribution

2.3 發(fā)酵時間對半干型發(fā)酵牛肉干感官品質(zhì)的影響

由圖3可知，不同發(fā)酵時間的半干型牛肉干組織狀態(tài)、色澤、風味、咀嚼性評分及感官總分存在顯著差異（P＜0.05），發(fā)酵12、24、36 h的半干型牛肉干組織狀態(tài)評分顯著高于空白組，發(fā)酵36 h的半干型牛肉干色澤、風味、咀嚼性評分以及感官總分均顯著高于其他組。發(fā)酵36 h的半干型牛肉干比其他組顏色更紅，其原因可能為沙克乳桿菌具有將棕色高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)變成亮紅色的亞硝基肌紅蛋白的能力[31]。Gao Xueqin等[32]發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，乳酸菌有能力使肉的顏色從棕色變成鮮紅色。感官總分整體呈先上升后下降的趨勢，其原因可能為發(fā)酵36 h內(nèi)的沙克乳桿菌生長良好，36 h后菌株進入衰退期，對產(chǎn)品的影響減弱[33]。并且發(fā)酵時間超過48 h后產(chǎn)品的酸度過高，不適合大多數(shù)消費者的感官需求。結(jié)果表明，發(fā)酵36 h的產(chǎn)品，感官效果最佳。

圖3 發(fā)酵時間對半干型發(fā)酵牛肉干組織狀態(tài)（A）、色澤（B）、 風味（C）、咀嚼性（D）、感官總分（E）的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on tissue status (A), color (B), flavor (C), chewiness (D) and overall sensory score (E) of semi-dried fermented beef jerky

2.4 半干型發(fā)酵牛肉干電子鼻分析

由圖4可知，PC1的貢獻率為67.5%，PC2的貢獻率為15.5%，二者可以代表83.0%的信息，因此其包括了半干型發(fā)酵牛肉干氣味物質(zhì)的大部分信息。未發(fā)酵牛肉干數(shù)據(jù)點與其他4 種半干型發(fā)酵牛肉干數(shù)據(jù)點均無重疊，說明發(fā)酵牛肉干與未發(fā)酵牛肉干的揮發(fā)性氣味差異性較大。發(fā)酵0、12、24 h數(shù)據(jù)點距離較近，說明這3 個發(fā)酵時間半干型牛肉干的整體風味相似。因此發(fā)酵產(chǎn)生特殊風味的時間應不低于24 h。由圖5可知，電子鼻的10 個傳感器對不同發(fā)酵時間發(fā)酵牛肉干氣味均能做出不同程度的響應。電子鼻W1C、W3C、W6S、W1S、W1W分別感應芳烴化合物、胺和部分芳香族化合物、氫化物、烷類化合物、硫化合物。電子鼻W5C感應烯烴、芳族、極性分子。電子鼻W2W感應芳烴化合物、硫的有機化合物。電子鼻W5S、W3S、W2S分別感應氮氧化合物、烷類和酯類、醇類和部分芳香族化合物。樣品在W5S、W3S的響應值隨著發(fā)酵時間延長而增加。W2S發(fā)酵后響應值高于未發(fā)酵響應值。說明沙克乳桿菌利用牛肉中的脂類等物質(zhì)產(chǎn)生了酯類、醇類等揮發(fā)性化合物，乳酸菌胞內(nèi)酯酶通過脂肪水解等化學反應改善肉制品風味，賦予半干型發(fā)酵牛肉干特殊的風味[34]。

圖4 電子鼻檢測半干型發(fā)酵牛肉干PCAFig. 4 PCA plot for electronic nose data of semi-dried fermented beef jerky

圖5 電子鼻檢測半干型發(fā)酵牛肉干的百分比堆積圖分析Fig. 5 Percentages of response signals of 10 electronic nose sensors for semi-dried fermented beef jerky

2.5 發(fā)酵時間對半干型發(fā)酵牛肉干蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響

使用Lab Spec 6軟件對酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）進行峰分離和曲線擬合[35]，計算得到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相對含量，如圖6所示，α-螺旋是對照組（0 h）蛋白二級結(jié)構(gòu)最主要的元素，其相對含量最高（67%），其次為無規(guī)卷曲（19%）、β-折疊（13%），而β-轉(zhuǎn)角相對含量最低（2%）。發(fā)酵后，半干型發(fā)酵牛肉干蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，隨著發(fā)酵時間的延長，α-螺旋相對含量呈先下降后上升的趨勢，β-折疊相對含量在24 h后整體呈上升趨勢，β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)卷曲相對含量呈先上升后下降的趨勢。在0～48 h內(nèi)半干型發(fā)酵牛肉干的部分α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊、無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，其表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由規(guī)整向松散轉(zhuǎn)化。到60 h，α-螺旋相對含量比48 h略有增加，說明部分α-螺旋結(jié)構(gòu)重新生成。α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量先減小后又增加，說明α-螺旋結(jié)構(gòu)在發(fā)酵過程中伸展和重新生成，可能在此時發(fā)生了結(jié)構(gòu)重組。pH值、鹽滲透等均可能導致發(fā)酵過程中蛋白構(gòu)象發(fā)生改變[12]。

圖6 半干型發(fā)酵牛肉干蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量Fig. 6 Relative contents of protein secondary structures in semi-dried fermented beef jerky

2.6 發(fā)酵時間對半干型發(fā)酵牛肉干二硫鍵的影響

二硫鍵主要有3 種模式，gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式（500～510 cm－1）、gauche-gauche-trans（g-g-t）模式（515～525 cm－1）與trans-gauche-trans（t-g-t）模式（535～545 cm－1）。由圖7可知，g-g-g構(gòu)象與g-g-t構(gòu)象是半干型發(fā)酵牛肉干中二硫鍵存在的主要形式。發(fā)酵0～48 h，隨著發(fā)酵時間的延長二硫鍵t-g-t構(gòu)型相對含量逐漸下降。蛋白質(zhì)中部分二硫鍵受到破壞，分子間的作用力降低，蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與功能 下降[36]，其原因可能為發(fā)酵降低pH值，導致部分蛋白更容易降解，這與2.1節(jié)的結(jié)果一致。發(fā)酵60 ht-g-t構(gòu)象略有上升，其原因可能為g-g-g、g-g-t構(gòu)象的二硫鍵向t-g-t構(gòu)象轉(zhuǎn)變。

圖7 半干型發(fā)酵牛肉干二硫鍵相對含量Fig. 7 Relative contents of three types of disulfide bonds in semi-dried fermented beef jerky

3 結(jié) 論

本研究對沙克乳桿菌發(fā)酵半干型牛肉干發(fā)酵過程中基本品質(zhì)進行了評價，結(jié)果表明，發(fā)酵24 h時，產(chǎn)品嫩度最好，當發(fā)酵時間不低于24 h時，產(chǎn)品風味與未發(fā)酵產(chǎn)品相比會發(fā)生明顯變化，說明要使發(fā)酵后的產(chǎn)品產(chǎn)生明顯發(fā)酵風味，發(fā)酵時間應不低于24 h。發(fā)酵36 h產(chǎn)品適口性較好，總體可接受度顯著高于其他組。發(fā)酵60 h產(chǎn)品過酸且嫩度較差，不符合大多數(shù)消費者的感官傾向。另外，發(fā)酵過程中，產(chǎn)品的不易流動水部分轉(zhuǎn)化為結(jié)合水，其延長產(chǎn)品的貨架期。α-螺旋結(jié)構(gòu)向其他無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，從而使蛋白質(zhì)更容易降解，風味更易產(chǎn)生。因此，以產(chǎn)品的感官、pH值和剪切力為主要考察依據(jù)時，半干型發(fā)酵牛肉干的最適發(fā)酵時間應控制在24～48 h之間。