增施有機(jī)肥對谷子耕地土壤細(xì)菌的影響

于寶海 王亞軍 賈洪男 趙俊國 孫奎倉 張 婷

（1承德市土壤肥料工作站 河北 承德 067000；2豐寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 河北 承德 067000；3承德市農(nóng)林科學(xué)院 河北 承德 067000）

隨著農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，農(nóng)藥和化學(xué)肥料被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，但藥物殘留對農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境造成嚴(yán)重影響。為保證糧食和環(huán)境安全，農(nóng)家肥和有機(jī)肥的施用顯得尤為重要。研究表明，增施有機(jī)肥不僅能為作物生長提供營養(yǎng)，提高作物抗病能力，而且還能夠提高土壤肥力，改善土壤環(huán)境，為綠色農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供有利條件[1]。

豐寧滿族自治縣位于河北省北部，地處北緯40°35′～42°0′，東經(jīng)115°14′～117°24′，海拔400～1 500 m，屬冀北山區(qū)。近年來，由于氣候不斷惡化，降水量明顯減少。而谷子作為一種重要的谷類作物，具有耐干旱、耐貧瘠和抗逆性強(qiáng)等特點，是該縣具有發(fā)展前景的農(nóng)作物。早在2015年豐寧縣委縣政府就把有機(jī)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)作為主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，并把有機(jī)谷子的生產(chǎn)作為重點項目來抓。有機(jī)谷子生產(chǎn)過程中不得使用任何化學(xué)肥料，必須使用有機(jī)肥。本試驗旨在探究增施商品有機(jī)肥對谷子耕地土壤微生物的影響，分析施肥前后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，為豐寧滿族自治縣有機(jī)谷子種植過程中合理施肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況。試驗地位于豐寧縣黃旗鎮(zhèn)有機(jī)農(nóng)業(yè)土壤培肥改良利用技術(shù)示范區(qū)，土壤類型為棕壤。試驗耕地已連續(xù)3年施用農(nóng)家肥(腐熟牛糞)，有機(jī)質(zhì)含量為55.5%，氮含量為1.57%，磷含量為0.085%，鉀含量為0.32%，施用量為1 800 kg/畝。有機(jī)肥為商品有機(jī)肥，有機(jī)質(zhì)含量≥45%，氮磷鉀含量≥5%。種植谷子品種為山西紅谷。

1.2 試驗設(shè)計。根據(jù)地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的施肥水平及土肥站測土配方要求，在有機(jī)谷子生產(chǎn)過程中進(jìn)行農(nóng)家肥和商品有機(jī)肥的配施，以改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力。試驗設(shè)4個處理：對照組(gz1)，只施農(nóng)家肥、不施商品有機(jī)肥，用量1 800 kg/畝；處理組(gz2)，施商品有機(jī)肥350 kg/畝+對照等用量農(nóng)家肥；處理組(gz3)，施商品有機(jī)肥700 kg/畝+對照等用量農(nóng)家肥；處理組(gz4)，施商品有機(jī)肥1 000 kg/畝+對照等用量農(nóng)家肥。播種前以農(nóng)家肥作底肥，中耕前追施商品有機(jī)肥。小區(qū)面積30 m2，播種行距45 cm，采用隨機(jī)區(qū)組排列。各處理除施肥水平不同外，田間管理一致。

1.3 土壤樣品采集及預(yù)處理。于谷子成熟期，以五點取樣法采集各處理組土壤樣品，放于密封袋中，帶回實驗室，備用。稱取200～500 mg的樣品，放入滅菌離心管中，加入1xPBS溶液，震蕩混勻后置于室溫下，10000r/min離心3min，棄上清，將離心管倒置于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取土壤樣品DNA。

1.4 土壤微生物分類檢測。DNA樣品質(zhì)檢合格后，利用細(xì)菌16SV3-V4區(qū)通用引物341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×HieffRobust PCR Master Mix 15μL，Bar-PCRprimer F 1μL，Primer R 1μL，PCRproducts 10～20ng，加水補(bǔ)足至30μL。反應(yīng)條件：94℃3min，94℃30 s，45℃20 s，65℃30 s，5個循環(huán)；94℃20s，55℃20s，72℃30s，20個循環(huán)；72℃5min。第2輪擴(kuò)增，引入Illumina橋式PCR兼容引物。反應(yīng)體系：2×Hieff○R Robust PCR Master Mix 15 ° L，Primer F 1μL，Index-PCRPrimer R 1μL，PCRproducts 20～30 ng，加水補(bǔ)足至30μL。反應(yīng)條件：95℃3 min，94℃20s，55℃20s，72℃30s，5個循環(huán)；72℃5min。利用Qubit3.0熒光定量儀進(jìn)行文庫濃度測定，應(yīng)用Illumina Miseq平臺進(jìn)行微生物分類測序，測序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 門水平土壤細(xì)菌群落差異。高通量測序結(jié)果分析顯示，4處理在門水平上，除去未鑒定類群和其他(將相對豐度＜1%的類群歸為其他)，共獲得11個細(xì)菌門(圖1)。變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主要優(yōu)勢細(xì)菌門。由圖1可知，施商品有機(jī)肥對土壤細(xì)菌門水平相對豐度產(chǎn)生了影響。變形菌門和放線菌門在對照處理中相對豐度最小，說明增施商品有機(jī)肥能夠增加土壤中變形菌門和放線菌門的數(shù)量，且施肥量越多相對豐度越大。酸桿菌門在對照處理中相對豐度最大，說明增施商品有機(jī)肥降低了土壤中酸桿菌門的數(shù)量，這與武曉森[2]等人的研究結(jié)果相一致，未施肥處理中放線菌門、變形菌門豐度明顯低于施肥處理，但酸桿菌門在對照處理中比例較高。研究表明，酸桿菌門生長速度較慢，當(dāng)土壤營養(yǎng)或結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時，生長較快的微生物將取代生長較慢的酸桿菌門，從而使酸桿菌門豐度降低[3]。另外，非優(yōu)勢菌門中藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)相對豐度表現(xiàn)為對照處理中最高，說明增施商品有機(jī)肥降低了藍(lán)細(xì)菌門的相對豐度。研究表明，藍(lán)細(xì)菌在貧瘠土壤固氮、固碳中發(fā)揮作用[4]，商品有機(jī)肥中含有氮磷鉀和有機(jī)質(zhì)，施肥后土壤肥力增加，從而使土壤中藍(lán)細(xì)菌相對豐度降低。

圖1 細(xì)菌門水平分布圖

2.2 屬水平土壤細(xì)菌群落差異。高通量測序共獲得細(xì)菌屬水平類群25個，包括未鑒定類群和其他(相對豐度＜1%)，4個處理中主要優(yōu)勢菌屬種類并無差異，但各優(yōu)勢菌屬相對豐度存在差異(圖3)。主要優(yōu)勢類群有鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Gp6、Gp4、芽單胞菌 屬(Gemmatimonas)、溶 桿 菌 屬(Lysobacter)、WPS-1_genera_incertae_sedis、Aridibacter、Gp3、Gp16、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、戴沃斯菌屬(Devosia)等11個細(xì)菌屬。由圖3可知，溶桿菌屬、Gp16和戴沃斯菌屬在增施商品有機(jī)肥后相對豐度增加，其中Gp16的相對豐度隨著商品有機(jī)肥的增加而增加，溶桿菌屬在gz2中相對豐度最大，戴沃斯菌屬在gz3中相對豐度最大。而Aridibacter和Gp3在施商品有機(jī)肥后相對豐度降低。研究表明，溶桿菌屬可以產(chǎn)生具有抗菌和裂解活性的次級代謝產(chǎn)物，在植物病蟲害防治及增強(qiáng)土壤抵抗力上具有重要作用[5]，戴沃斯菌屬可以與水生豆科類植物Neptunia natans(L.F.)Druce共生形成獨特的固氮結(jié)節(jié)[6]。

圖3 細(xì)菌屬水平分布圖

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果顯示，4個處理土壤細(xì)菌優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬相同，只是在相對豐度上存在差異，說明增施商品有機(jī)肥盡管增加或降低了一些細(xì)菌的相對豐度，但并未引起土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。與只施農(nóng)家肥相比，在門水平上，增施商品有機(jī)肥能夠明顯增加土壤中變形菌門和放線菌門的相對豐度，降低酸桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門的相對豐度；在屬水平上，增施商品有機(jī)肥增加了土壤中溶桿菌屬、Gp16、戴沃斯菌屬、WPS-1_genera_incertae_sedis等細(xì)菌屬的相對豐度，降低了Aridibacter和Gp3的相對豐度。但細(xì)菌門屬的相對豐度增加或降低與施肥量并未表現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，推測可能由于施肥時間相對較短，而土壤微生物的演變需要一定的時間。

施肥是土壤微生物演變的重要驅(qū)動因子之一。與化肥相比，有機(jī)肥的時效性和持久性更好。一方面，有機(jī)肥中含有氮磷鉀和有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，能直接增加土壤養(yǎng)分，促進(jìn)谷子生長；另一方面，有機(jī)肥增加了外部碳源的輸入，有助于土壤微生物的生長繁殖，增強(qiáng)了微生物的代謝活動[7]，改善了土壤結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)一步促進(jìn)谷子根系營養(yǎng)的吸收和地上部分的生長。因此，在實際生產(chǎn)中，科學(xué)合理施用有機(jī)肥和農(nóng)家肥，有利于調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，改善土壤環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。