黃花酵素發酵工藝優化

張江寧，楊春，南曉潔，郭尚

山西農業大學山西功能食品研究院（太原 030031）

黃花菜被列為“四大素山珍”之一，色澤金黃，香味濃郁，味道鮮美，營養價值高，富含糖類、蛋白質、維生素、無機鹽及多種人體必需的氨基酸，具有平肝養血、消腫利尿、抗菌消炎、止血、鎮痛、通乳、健胃和安神的功能。研究發現鮮黃花菜經冷凍干燥，其總黃酮、總氨基酸、總糖含量明顯高于自然干制黃花菜，冷凍干燥工藝能最大限度地保留黃花菜營養成分，并且實現及時加工。但是目前對于冷凍干燥黃花菜相關產品的開發較少。此次試驗以冷凍干燥黃花菜為發酵主原料，在發酵液中適當添加碳源，選用經馴化的乳酸菌作為發酵菌種，對乳酸菌發酵黃花菜的工藝進行優化，為黃花菜的利用提供一種新的思路，這不僅能夠最大化利用黃花菜這種優質資源，還能促進黃花菜產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍干燥黃花菜，大同冰華食品有限公司；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），菌種由實驗室提供。氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、濃鹽酸、福林酚、沒食子酸、甲基紅、葡萄糖、次甲基藍、亞鐵氰化鉀，市售。

1.2 儀器與設備

電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；721型分光光度計（上海光學儀器廠）；發酵罐（賽多利斯集團）；恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）；電熱鼓風恒溫干燥器（上海森信實驗儀器有限公司）；水浴鍋（金壇市億能實驗儀器廠）；離心機（上海繼譜電子科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 發酵黃花菜酵素的制備流程

1.3.2 操作要點

將冷凍干燥黃花菜粉碎，按照一定料液比加入水，煮沸并保持3 min。冷卻至40 ℃后，接種菌種，于室溫條件避光發酵一定時間后，置于離心管中，在8000 r/min條件下離心10 min，棄沉淀物，將得到的上清液置于-20 ℃保存，待測。

1.3.3 測定指標與測定方法

1.3.3.1 總糖測定

總糖參照GB/T 10782—2006《食品中總糖的測定》的方法測定。

1.3.3.2 總酸測定

總酸參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》的方法測定，測定結果以乳酸質量濃度（g/100 mL）計。

1.3.3.3 總酚測定

參照蔣增良等[1]的方法，采用福林酚法檢測總酚。

1.3.3.4 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件及SPSS 24.0軟件進行數據處理及分析。

1.3.4 單因素試驗

以黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚質量分數為評價指標，考察糖添加量、菌種接種量、料液比、發酵溫度、發酵時間5個因素對產品品質的影響，并確定各因素的最佳值。單因素試驗采用的固定參數為冷凍干燥黃花菜20 g、料液比6%、蔗糖添加量3%、接種量0.5%、發酵溫度37 ℃、發酵時間6 d。固定其他因素，變化一個因素進行優化，因素變化范圍為料液比（2%～8%）、蔗糖添加量（1%～7%）、接種量（0.1%～0.7%）、發酵溫度（31～40 ℃）、發酵時間（0～8 d）。

1.3.5 響應面試驗設計

參數運用二次正交旋轉組合設計進行優化，以影響產品質量主要參數作為輸入變量，評估產品質量指標作為輸出變量。根據單因素試驗結果，將接種量、發酵溫度、發酵時間作為試驗因素。為更全面地考察因素對結果的影響，將總酸、總多酚作為響應值，進行三因素三水平共17個試驗點的響應面分析試驗，優化生產工藝，每個組合重復試驗3次，試驗因素水平編碼見表2。

表1 試驗因素水平編碼表

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 糖添加量對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚的影響

以糖類物質作為微生物發酵過程中的主要碳源，通過總糖質量分數變化分析微生物生長和代謝狀況[2]。總酸也是衡量發酵成熟度的主要指標，同時也是反映其質量品質的重要理化指標[3]，糖添加量對黃花菜發酵總糖、總酸、總多酚影響的結果如圖1和圖2所示。當糖添加量小于3%時，總糖質量分數不斷降低，總酸質量分數升高，多酚質量濃度增加。當糖添加量大于3%時，總糖質量分數不斷增加，總酸質量分數雖有波動但區別不大，多酚質量濃度降低。總糖、總酸質量分數代表發酵進行的程度，總糖質量分數越低，總酸質量分數越高，發酵越徹底，同時原料利用率越高。綜合考慮，最終糖添加量選用3%。

圖1 糖添加量對總糖、總酸質量分數的影響

圖2 糖添加量對總多酚質量濃度的影響

2.1.2 菌種接種量對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚的影響

由圖3可知：隨著接種量增加，總酸質量分數不斷升高，總糖質量分數不斷降低，說明菌種的加入有效促進發酵反應。當接種量小于0.3%時，總糖質量分數下降不明顯。當接種量大于0.3%時，總糖質量分數明顯下降，這說明接種量太低導致菌體在發酵過程中生長較慢，故代謝少，而大的接種量有利于縮短菌體生長的調整期，加速總糖降解。由圖4可知：當接種量為0.5%時，總多酚質量濃度最高，這是由于乳酸菌產生的酶類及有機酸使黃花菜中酚類物質溶出并呈游離態，導致發酵過程中總酚質量濃度上升；當接種量為0.7%時，總多酚質量濃度又有所下降，這可能是由優勢菌種為維持自身生長產生降解酚類的物質造成的。為使總糖較低、多酚較高，接種量選擇0.5%。

圖3 接種量對總糖、總酸質量分數的影響

圖4 接種量對總多酚質量濃度的影響

2.1.3 料液比對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚的影響

由圖5可知：隨著料液比增加，總糖質量分數逐漸增大，之后趨于穩定，總酸質量分數逐漸增大，說明發酵過程中的發酵速度與發酵用原料濃度密切相關。料液比過低，物料中有效溶出物過低，因此總糖、總酸處于較低水平，隨著料液比增加，溶出物增加，發酵產物增多，發酵徹底。由圖6可知：當料液比為6%時，總多酚質量濃度趨于穩定；物料繼續增多，總多酚質量濃度并未明顯增加，這是由于物料濃度過高不利于菌種的生長以及總多酚溶出。綜合考慮，料液比選擇6%。

圖5 料液比對總糖、總酸質量分數的影響

圖6 料液比對總多酚質量濃度的影響

2.1.4 發酵溫度對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚質量分數的影響

由圖7可知：當溫度低于37 ℃時，隨著發酵溫度升高，總糖質量分數逐漸降低，之后趨于穩定，總酸質量分數逐漸增大，說明發酵溫度過低直接影響菌絲生長、影響總糖的降解與總酸生成；當發酵溫度為37℃時，總糖質量分數最低，總酸質量分數最大，說明發酵徹底，原料利用率高。由圖8可知：溫度變化對總多酚質量濃度的影響不大，說明該溫度變化范圍不足以對多酚的累計構成影響。綜合考慮，發酵溫度選擇37 ℃。

圖7 發酵溫度對總糖、總酸質量分數的影響

圖8 發酵溫度對總多酚質量濃度的影響

2.1.5 發酵時間對黃花菜酵素總糖、總酸、總多酚質量分數的影響

從圖9和圖10可以看出：前2 d總糖質量分數增加，這可能是發酵前期總糖在高滲透壓下從黃花菜中溶至發酵液中，溶出速率大于降解速率；2 d后總糖持續下降，總酸質量分數迅速增加，說明原料迅速發酵，總糖降解快速，同時總酚質量濃度快速增加，說明發酵過程可以顯著提高酵素中的總酚質量濃度；發酵至第6天時，總酸質量分數與多酚質量濃度達到最大值，之后趨于穩定。綜合考慮，發酵時間選擇6 d。除黃花菜酵素外，已有報道表明在藍莓酵素、葡萄酵素天然發酵過程中總酚質量分數呈逐漸上升趨勢，發酵結束后二者的總酚質量濃度分別為1.74和2.31 mg/mL[4-5]。

圖9 發酵時間對總糖、總酸質量分數的影響

圖10 發酵時間對總多酚質量濃度的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 試驗設計方案及結果

響應面試驗設計及統計結果見表2。利用統計軟件Design-Expert 8.0.6.1進行試驗設計和數據分析[6]。

表2 Box-Benhnken試驗設計及響應值的實測值

2.2.2 模型方程的建立及變量分析

利用統計軟件Design Expert對試驗數據進行分析，可得到各因素與總酸、總多酚質量分數之間的回歸方程式，通過對響應面數據進行回歸分析，擬合后得到二次多項回歸方程（1）和（2）：

由表3可知[7]：從方差分析可見，試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性（p＜0.0001），總酸校正決定系數（R2）為0.993，總多酚校正決定系數（R2）為0.9795，表明應變量與自變量之間的多元回歸關系顯著，此模型擬合度好，說明試驗設計合理，該回歸模型可代替試驗真實點設計試驗。因此在確定最佳工藝時，以總酸、總多酚作為主要考察對象，通過對回歸系數的校驗，影響產品總酸的因素主次順序為發酵時間＞接種量＞發酵溫度；影響產品總多酚的因素主次順序為發酵時間＞接種量＞發酵溫度。

表3 回歸模型方差分析

2.3 交互作用分析

2.3.1 三因素對產品總酸的影響

為了研究三因素的變化與響應值之間的關系，通過固定一個因素為0水平，研究另外兩個因素的交互作用，得到三維立體圖。根據這些方程得到三因素的交互效應三維立體圖和等高線圖，考察響應面圖的形狀。等高線的形狀反映交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形與之相反[9]。由圖11等高線圖可以看出：這3個因素間的交互作用不顯著，這與回歸模型方差分析的計算結果一致。隨著接種量增加，產品總酸先增加后減小，總酸質量分數變化是由發酵過程中乙酸、乳酸等有機酸質量分數增加所致[10]，因此菌種濃度在一定范圍內會促進發酵反應，總酸質量分數增加，但是當增加到一定濃度時，菌種代謝消耗營養物質大于代謝產物積累，因此總酸質量分數減少；隨著發酵時間延長，總酸質量分數不斷增加，說明發酵時間有利于總酸的積累；發酵溫度提高，總酸質量分數是先增大后減小的。

圖11 三因素對產品總酸的影響

2.3.2 三因素對產品總多酚的影響

總多酚是產品潛在功能性的表現，很多研究表明多酚類物質在抗誘變、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化等方面具有顯著的作用[11]。黃花菜多酚對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH 自由基均具有一定的清除作用，且清除率與黃花菜多酚濃度呈量效關系[12]，因此盡可能保留總多酚質量分數對黃花菜發酵具有重要意義。

從圖12等高線圖可看出：接種量與發酵溫度近似圓形，因此交互作用不明顯，接種量與發酵時間、發酵溫度與發酵時間呈橢圓形，有一定的交互作用。從圖12響應面圖可知：隨著接種量增加，產品總多酚先增加后減小，這是由于菌種濃度在一定范圍內會促進發酵反應，總酸質量分數增加，但是當增加到一定濃度時，菌種代謝消耗營養物質大于代謝產物積累，因此總酸質量分數減少；隨著發酵時間延長，總多酚質量濃度不斷增加，說明發酵時間有利于總多酚的積累，但是發酵后期總多酚濃度分數減少，原因可能是時間過長，多酚發生降解、氧化等化學反應致使多酚分子結構發生一定的破壞；發酵溫度提高，總多酚質量濃度先增大后減小。

圖12 三因素對產品總多酚質量濃度的影響

2.4 最佳工藝條件下驗證試驗

為了驗證模型的有效性，利用SAS 8.0軟件的優化功能，得到發酵液接種量0.53%、發酵溫度37.5 ℃、發酵時間6.2 d。在最優工藝條件下進行驗證性試驗，由表4可知，總酸、總多酚實測值與預測值相差較小，對結果進行修正，說明此模型有效。

表4 最佳工藝條件下驗證試驗

3 結論

以黃花菜乳酸發酵總糖、總酸、總多酚為評價指標，通過單因素試驗考察5個因素對產品品質的影響。結果表明，料液比6%，蔗糖添加量3%，菌種接種量0.5%，在37 ℃下發酵6 d，效果較好。利用Box-Behnken統計學試驗設計方法建立了總酸、總多酚的二次多項數學模型。影響產品總酸的因素主次順序為發酵時間＞接種量＞發酵溫度；影響產品總多酚的因素主次順序為發酵時間＞接種量＞發酵溫度。通過對模型方程3D圖及其等高線圖的分析，明確了因素間交互作用并獲得了最佳處理條件。結果表明：發酵時間、接種量、發酵溫度對總酸的影響交互作用不顯著；接種量與發酵溫度對總多酚的影響交互作用不明顯，接種量與發酵時間、發酵溫度與發酵時間對總多酚的影響有一定的交互作用。利用模型方程可以預測黃花菜乳酸發酵總酸質量分數、總多酚質量濃度變化趨勢，方程預測值與實際值之間具有較好的擬合度，其最優工藝參數為接種量0.53%、發酵溫度37.5 ℃、發酵時間6.2 d，在此條件下總酸實測值為18.7 g/kg，總多酚實測值為83.4 mg/100 mL。