牛羊水間充質干細胞對小鼠酒精性肝病的影響

紀洪兵，宋哈楠，趙詩宇，張 濤，關偉軍*

(1.佳木斯大學基礎醫學院，佳木斯 154007； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

羊水間充質干細胞(AF-MSCs)在20世紀初首次被分離和研究，其具有體外擴增和緊密合成支架能力，是作為選擇胎兒組織構建體工程的可靠且實用的細胞來源[1-2]。AF-MSCs廣泛應用的原因主要是：1)AF-MSCs 可以在羊膜穿刺術期間收集，從原本會被丟棄的材料中分離出來，不會受到倫理爭論的影響；2)與其他胎兒來源的干細胞一樣，AF-MSCs便于儲存且成本較低；3)羊水是多能干細胞的來源，細胞群體易擴大且能夠長期保存而不會產生不良影響，可以用于器官再生。與胚胎干細胞(ES)不同的是，羊水來源的干細胞在注射到裸鼠皮下時不會形成畸胎瘤[3]。AF-MSCs已經應用于抗腫瘤、神經元再生、壞死性結腸炎、皮膚損傷及缺血性心臟病等研究中，能夠分泌多種細胞毒性細胞因子靶向作用癌細胞，使癌細胞凋亡；還可以分泌保護性、營養性因子促進局部組織再生，顯示出其多能分化性、非致瘤性、低免疫原性、抗纖維化反應[4-8]。經過20多年的探索，我國國家家養動物種質資源庫成功建立，能夠保存各類遺傳物資，目前，已保存體細胞和干細胞約9萬余份。本研究中的牛AF-MSCs分離培養并純化后，代次小、活力好的優質細胞將入儲存庫用于資源保存，另一部分將入應用庫用于后續生命科學研究。

酒精性肝病(ALD)是一種由過量飲酒引起的廣譜疾病，從早期的單純性脂肪變性、酒精性肝炎、肝硬化，到晚期的肝細胞癌。盡管有許多改善ALD預后的嘗試，但晚期ALD的治療仍然基于禁酒、短暫皮質類固醇支持或肝移植等辦法。治療ALD的幾種方法主要是針對肝再生能力的恢復，如細胞因子誘導、干細胞移植和建立3D人工肝[9-12]。HIF-1α作為調節肝氧化應激、脂質代謝的關鍵因子，參與低氧應激基因的表達與氧穩態平衡。VEGF是其最重要的下游調控基因之一，HIF-1α/VEGF信號通路對細胞遷移及門靜脈高壓以及側支循環的建立均有一定影響，亦成為眾多疾病的致病機制及治療的靶標。而TLR4與配體結合后，激活NF-κB，同時觸發宿主炎癥反應中促炎性基因的表達、活化及炎癥因子釋放從而引起促炎作用。在自體骨相關髓間充質干細胞(MSCs)治療慢性肝病中，大多都涉及粒細胞集落刺激因子(G-CSF)動員MSCs或直接采集并移入外周或肝血管系統，但臨床受試者樣本量少，病因亦不同，導致慢性肝病未來研究的方向仍不確定。有研究報道，自體AF-MSCs移植能改善四氯化碳(CCl4)導致的肝纖維化，并成功示蹤移植細胞在體內的分布狀態[13]。而牛AF-MSCs用于小鼠ALD模型在國內外鮮見報道。水飛薊賓膠囊(水飛薊素類)作為早期ALD、急慢性肝炎肝功能異常恢復的推薦藥物[14]，選取其作為本研究的陽性藥物，與牛AF-MSCs對比探討ALD小鼠的治療效果與其可能的作用機制，為臨床獸醫和臨床治療在細胞種屬與來源方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 4～5月齡雌性胎牛來自北京畜牧獸醫研究所昌平實驗基地。48只SPF級ICR雄性小鼠， 6～8周齡，體重32～36 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗單位使用許可證編號SYXK(京)2019-0046。飼養于中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所實驗動物中心SPF級飼養室，實驗動物使用許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.1.2 藥品 水飛薊賓膠囊，購自天津天士力圣特制藥，國藥準字H20040299。

1.1.3 主要儀器及試劑 恒溫CO2培養箱購自德國賀利氏公司；離心機購自艾本德中國有限公司；TE-2000-E共聚焦顯微鏡購自日本尼康公司；多功能掃描成像分析系統和實時熒光定量PCR儀均購自伯樂公司。L-DMEM、胎牛血清(FBS)、山羊血清均購自Gibco公司；胰蛋白酶(Trypsin1:250)、EDTA、DMSO、Triton-X100均購自Sigma公司；抗CD44、CD73、CD71、SSEA4、OCT4兔源抗體及山羊抗兔-FITC均購自北京博奧森生物技術有限公司；Dil碘化物購自北京富百科生物技術有限公司；ALT、AST、TG測定試劑盒購自長春匯力生物技術有限公司；反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司；動物組織總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(上海)有限公司。

1.1.4 試劑配制 試劑配制參考Gao等[15]的研究。水飛薊賓膠囊內容物溶劑：成年人210～420 mg · d-1，按體表面積劑量折算小鼠1.2～2.4 mg · d-1，將水飛薊賓膠囊內容物1.2 mg溶于0.1 mL 56度紅星二鍋頭(現用現配)。

1.1.5 引物設計及合成 參照GenBank中牛、小鼠基因mRNA 序列設計同源引物，應用Primer Premier 5.0 軟件設計擴增各基因CDS區，引物信息見表1、2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 AF-MSCs分離培養 無菌條件下剖宮產后的胎牛(4～5月)，用冷藏箱在4～8 h內運送到實驗室，在無菌條件下用50 mL注射器穿刺羊膜層，收集羊水，3 000 r · min-1離心9 min。用100 mL無菌離心管連續向同一離心管內注入羊水收集細胞，將細胞以1×103個 · mL-1接種到12孔板中，在37 ℃，5%CO2培養箱中孵育。接種后48 h，用PBS沖洗細胞2次，去除未貼壁細胞。當細胞達到70%～80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養。

1.2.2 AF-MSCs的RT-PCR鑒定 選取P5代細胞當融合至80%～90%時，TRIzol 1 ml裂解5 min； 轉移至無RNase EP管，200 μL氯仿劇烈震蕩，室溫靜置5 min；4 ℃，12 000 r · min-1離心15 min；取上層水相加入等體積異丙醇，震蕩后靜置15 min；4 ℃，12 000 r · min-1離心15 min；75%乙醇清洗管底沉淀，離心同上；晾干加入dH2O 30 μL，得到總RNA溶液。利用反轉錄試劑盒合成cDNA。 反轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，4 ℃保存。PCR反應體系 20 μL：2 ×TaqPCR StarMix with Loading Dye 10 μL，RNase Free dH2O 7 μL，上、下游引物及cDNA模板各1 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 1 min，60 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共30個循環；72 ℃ 7 min。

1.2.3 AF-MSCs的免疫熒光鑒定 用37 ℃溫預4%多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100室溫通透15 min，PBS洗3次；1∶10山羊血清室溫封閉30 min；兔源CD29、CD73、SSEA4和OCT4一抗1∶100稀釋，4 ℃孵育過夜；FITC標記二抗1∶100稀釋，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min。DAPI核染，室溫15 min，PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下拍照并觀察。

1.2.4 AF-MSCs成脂誘導 L-DMEM+1 μmol · L-1地塞米松、5 μg · mL-1胰島素、0.5 mmol · L-1異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)和60 μmol · L-1吲哚美辛的培養基中培養2周，每2 d更換一次誘導培養基。

1.3 動物模型制備與檢測

1.3.1 造模 48只ICR小鼠隨機分為4組：空白對照組(BC組)、模型對照組(MC組)、AF-MSCs組(MC+AF-MSCs組)、水飛薊賓膠囊(SC)組(MC+SC組)，每組12只。適應性飼養7 d，第8天除BC組以外，其余試驗組均以56度紅星二鍋頭灌胃，5 g · kg-1，2次 · d-1連續4周。第5周試驗前12 h MC+AF-MSCs組小鼠禁食不禁水，麻醉后左肋下緣處縱開口0.5 cm，暴露肝左葉，將Dil標記細胞懸液用微量注射器注射50 μL。同時MC+SC組行水飛薊賓膠囊內容物溶劑灌胃，2次 · d-1共2.4 mg，共1 d。

1.3.2 小鼠血清檢測 2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，眼球取血，室溫靜置30 min，3 000 r · min-1離心20 min分離血清。根據ALT、AST和TG測定試劑盒說明書，檢測特定波長OD值，根據公式換算活性。

1.3.3 肝組織HE及免疫組化染色 麻醉后取肝左葉組織固定液固定過夜后，常規脫水、石蠟和OCT包埋、切片，油紅O染色，光鏡下選取相同的病變區域準確觀察肝小葉脂肪病變情況。

1.3.4 Dil標記AF-MSCs Dil碘化物儲存液：Dil粉末10 mg，溶于10 mL DMSO溶解配置終濃度1 mmol·L-1于-20 ℃，避免反復凍融。稀釋儲存液至終濃度為5 μmol·L-1的工作液，P5代懸浮細胞(1×108個·mL-1)加入工作液中37 ℃孵育25 min， 1 000 r · min- 1離心5 min，棄上清，加入37 ℃基礎培養基1 mL。

1.3.5 實時熒光定量PCR 小鼠麻醉后取肝尾狀葉迅速放置凍存管中液氮保存，利用動物組織總RNA提取試劑盒提取小鼠肝總RNA，并及時反轉錄合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系25 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，TB Green Premix ExTaqⅡ 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣品最少進行3個重復。

表2 實時熒光定量 PCR引物序列

1.3.6 數據處理 數據使用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析及鄧肯氏多重比較，用“平均值±標準差”表示，實時熒光定量PCR數據使用BC組歸一后進行分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 AF-MSCs的形態

倒置相差顯微鏡觀察發現，AF-MSCs接種72 h后貼壁至孔板的80%～90%；初次傳代48 h后，AF-MSCs與多種類型細胞混合生長；繼續傳至3～4代，其他類型細胞從群體中分離并消失，AF-MSCs呈現出獨特的漩渦狀，不同代次細胞之間形態無明顯差異，連續傳代后細胞形態保持穩定(圖1)。

A. 原代培養72 h；B. P1代AF-MSCs與多種類型細胞混合生長；C. P3代呈現獨特漩渦狀A. Primary culture for 72 h; B. Passage 1, many type cells type were mixed with the AF-MSCs; C. Passage 3, which displayed a unique vortex shape圖1 牛AF-MSCs形態Fig.1 Morphology of bovine AF-MSCs

2.2 AF-MSCs鑒定

2.2.1 RT-PCR擴增及免疫熒光 RT-PCR結果顯示，CD44、CD73、SSEA、OCT4呈陽性表達，CD34和CD45呈陰性表達(圖2)；在AF-MSCs細胞中檢測CD29、CD73、SSEA4、OCT4表面標記物，在共聚焦顯微鏡下掃描，結果表明，上述抗體均呈陽性細胞質表達(圖3)，說明分離培養細胞為羊水間充質干細胞。

M. DNA相對分子質量標準；1. GAPDH；2. CD44；3. CD73；4. SSEA；5. OCT4；6. CD34；7. CD45M. DL 600 DNA Marker; 1. GAPDH; 2. CD44; 3. CD73; 4. SSEA; 5. OCT4; 6. CD34; 7. CD45圖2 AF-MSCs表面標記物RT-PCR檢測Fig.2 RT-PCR identification of AF-MSCs surface markers

圖3 AF-MSCs表面標記熒光表達Fig.3 Immunofluorescence expression of AF-MSCs surface markers

2.2.2 誘導分化 在完全培養基中培養的陰性對照細胞，油紅O染色呈陰性；在誘導14 d后，細胞內可見脂滴出現。隨著成脂培養基培養時間的延長，液滴的數量增加，小液滴聚集形成更大的液滴。油紅O染色陽性證明AF-MSCs脂肪細胞分化；RT-PCR檢測發現，AF-MSCs誘導前PPAR-γ和LPL呈陰性表達，誘導后PPAR-γ和LPL呈陽性表達(圖4)。

2.3 AF-MSCs和SC對ALD小鼠血清ALT、AST和TG活性的影響

由圖5可知，與BC組相比，MC組ALT、AST和TG活性極顯著升高(P<0.01)；與MC組相比，MC+AF-MSCs組和MC+SC組ALT、AST和TG極顯著降低(P<0.01)；與MC+SC組相比，MC+AF-MSCs組ALT極顯著的降低(P<0.01)，AST顯著降低(P<0.05)，而TG活性無顯著差異(P>0.05)。該結果說明牛AF-MSCs移植與常規用藥均能改善肝功能，但牛AF-MSCs降低ALT、AST活性較SC顯著。

A. 對照組油紅O呈陰性；B. 成脂培養基誘導14 d，成纖維樣細胞變扁平并形成大脂滴；C. 對照組PPAR-γ、LPL均為陰性；D. 誘導組PPAR-γ、LPL均為陽性，GADPH作為內參。1. GAPDH；2. LPL；3. PPAR-γ；M. DNA相對分子質量標準A. Control group were negative for oil red O dye; B. After induction for 14 d, AF-MSCs became fibroblast-like to oblate and formed large lipid droplets; C. PPAR-γ and LPL were negative in the control group; D. PPAR-γ and LPL were positive in the inducted group, GAPDH served as the internal control. 1. GAPDH；2. LPL；3. PPAR-γ；M. DL600DNA marker圖4 AF-MSCs成脂誘導形態學及脂肪細胞特異性基因RT-PCR檢測Fig.4 Lipid induction of AF-MSCs and detection of adipocyte-specific genes by RT-PCR

2.4 AF-MSCs和SC干預后ALD小鼠肝組織HE和油紅O染色情況

BC組肝組織無明顯病理改變，肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，肝血竇正常(圖6A、E)。經4周酒精灌胃，MC組肝細胞邊界模糊出現脂肪滴及肝血竇充血等病理改變(圖6B)，且油紅O染色證實，肝細胞存在大量脂質沉積(脂質呈紅色，圖6F)；SC治療后炎癥細胞浸潤，但脂肪性變稍有輕微(圖6C、H)；AF-MSCs干預后脂肪滴及脂質沉積范圍較MC+SC組明顯縮小(圖6D、G)。

肩標不同小字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05); With different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below圖5 小鼠血清ALT、AST和TG活性檢測Fig.5 Detection of ALT, AST and TG activities in serum of mice

2.5 Dil細胞示蹤移植AF-MSCs

熒光顯微鏡下觀察肝組織冰凍切片發現，未進行細胞移植的冰凍切片在549 nm波長下Dil呈陰性(圖7A～C)。而 Dil標記AF-MSCs移植后48 h，可見AF-MSCs分布在小鼠肝組織中，產生歸巢效應并定植在受損組織周圍(圖7D～F)。

2.6 AF-MSCs和SC對ALD小鼠 HIF-1α、TLR4、VEGF基因表達量的影響

各組小鼠肝組織HIF-1α、TLR4、VEGF相對表達量見圖8。可知與BC組相比，MC組HIF-1α、TLR4、VEGF表達量均極顯著高(P<0.01)；與MC組相比，MC+AF-MSCs組及SC組表達三種基因均極顯著降低(P<0.01)。與MC+SC組相比，MC+AF-MSCs組極顯著低下調上述基因，其中經AF-MSCs干預后的HIF-1α表達量趨于BC組。

A、E. BC組；B、F. MC組；C、H. MC+SC組；D、G. MC+AF-MSCs組A, E. Group BC; B, F. Group MC; C, H. Group MC+SC; D, G. Group MC+AF-MSCs圖6 小鼠肝組織HE染色(上排)及油紅O染色(下排)Fig.6 The HE staining (upper row) and oil red O staining (lower row) of mouse liver

A、D. Dil標記熒光；B、E. DAPI核染；C、F. 疊加A, D. Luorescence labelled by Dil; B, E. DAPI nuclear dyeing; C, F. Merged圖7 Dil細胞示蹤劑標記移植AF-MSCs冰凍切片Fig.7 Tissue freezing section of AF-MSCs labelled by Dil

圖8 HIF-1α、TLR4、VEGF基因mRNA表達量比較分析Fig.8 Comparative analysis of mRNA expression levels of HIF-1α、TLR4、VEGF genes

3 討 論

3.1 羊水間充質干細胞

羊水來源MSCs因其在體外群體易擴大、免疫原性低且及不涉及倫理糾紛等優勢，比其他來源干細胞更適合用于再生醫學及基礎獸醫領域的研究。有研究將來自不同種實驗動物的睪丸間充質干細胞移植到免疫缺陷小鼠后，供體細胞可在受體組織基底形成克隆，但向目的細胞分化不完整[16-17]。油紅O染色及RT-PCR結果顯示，AF-MSCs中出現橘紅色脂肪滴、PPAR-γ和LPLmRNA呈陽性表達，說明AF-MSCs可誘導向脂肪細胞進行分化。據報道，AF-MSCs分離初期，與其混合生長的上皮樣細胞和纖維樣細胞分別來源于胎兒皮膚、尿液和纖維結締組織、真皮成纖維細胞[18]，本研究研究分離的AF-MSCs傳至3、4代后，細胞得以純化，這與Prusa等[19]的研究結果相似。Dario[20]報道的人羊水來源的干細胞表達CD29、CD44、CD73和OCT4等特異性標志，但不表達CD45和CD34，這與本研究結果相一致，說明AF-MSCs與胚胎干細胞(ES細胞)共表達OCT4，且有研究表明[21]，OCT4在牛卵母細胞和早期胚胎發育過程中均有表達，也說明AF-MSCs可能具有與ES細胞相似的特征。本試驗結果標明，試驗成功分離到牛AF-MSCs并有誘導成脂分化的能力。

3.2 AF-MSCs對ALD小鼠的影響

至今ALD的發病機制尚不明確，但研究表明，主要機制涉及氧化應激、炎癥作用、腸道菌群易位、細胞死亡和再生障礙等[22-25]。長期飲酒會增加肝的耗氧量，導致肝中樞及周圍缺氧，HIF-1α作為在低氧狀態下發揮活性的轉錄因子，在常氧情況下α亞基在特定的脯氨酸殘基處被羥基化，從而使腫瘤抑制因子泛素化，泛素化將其靶向于蛋白酶體降解；在低氧情況下α亞基穩定并易位至細胞核，在其中與HIF-1β二聚化并調節靶基因的表達。Nath等[26]報道，當HIF-1α缺失時，小鼠肝脂肪性變減輕及血清TG活性降低。而本研究通過qRT-PCR檢測各組小鼠肝HIF-1α相對表達量，發現長期飲酒會導致肝中HIF-1α水平升高和活化，在HIF-1α表達降低時，肝脂肪沉積及血清TG活性均顯著減輕，與其結果相一致。本研究細胞示蹤結果顯示，經肝外移植的牛AF-MSCs成功定植并向受損肝組織部位歸巢，完成了干細胞有效治療的必要條件。且MSCs具有趨化性，在靜脈注射后，能響應炎癥條件并附著于內皮，并在內皮細胞之間向受損組織遷移。本研究中qRT-PCR結果顯示，經AF-MSCs干預的肝組織中VEGFmRNA水平降低，說明植入的細胞可抑制VEGF表達，使血管通透性恢復，進而改善肝血竇充血，Zhang等[27]利用斑馬魚模型證明，急性酒精暴露經治療后，通過對血管內皮生長因子受體(VEGFR)活性的阻斷，不能與其配體結合發揮分子作用從而改善肝脂肪變性、血管生成來增強肝修復，與本試驗結果相符。本研究中，牛AF-MSCs下調ALD小鼠肝組織中TLR4，其主要來源可能位于肝細胞而非髓系細胞，原因在于Jia等[28]曾報道，敲除小鼠肝細胞和髓系細胞中TLR4，在急性酗酒模型中肝細胞TLR4缺陷小鼠的血清ALT、TG含量降低。相反，髓系細胞中缺失TLR4則不影響酒精脂肪肝的發展。本試驗對比了牛AF-MSCs與SC對酒精導致的小鼠肝損傷在血清學、病理學及基因表達的影響，研究初步結果顯示，牛AF-MSCs干預后小鼠存活率達到100%且治療的效果優于SC。這對今后基礎獸醫研究異種干細胞移植治療慢性肝病及臨床治療ALD方面提供了有效參考，同時也可考慮將干細胞移植的來源目標轉移至家養動物身上，在再生醫學中生產并推廣應用。

4 結 論

本研究成功分離、培養并鑒定了牛AF-MSCs，移植入ALD小鼠后，證實對降低血清ALT、AST及TG在體內的活性以及減輕肝脂肪性變是有效的。牛AF-MSCs在一定程度上能抑制HIF-1α/VEGF信號通路，下調TLR4的表達，其綜合效果優于SC。提示牛AF-MSCs對小鼠ALD病程中的肝功能具有改善作用。