兩株石油降解真菌生物學特性及降解能力研究

覃俊艷

（百色市食品藥品檢驗所，廣西 百色 533000）

石油烴類污染物一旦流入海洋，對人類健康、海洋動植物及微生物、旅游業(yè)等多方面都會造成嚴重危害，甚至威脅人類和動物的生命。鑒于石油烴類污染的危害性大，這類污染防治引起了世界各國的重視。化學修復、物理修復、生物修復是當前已知且常用的三大環(huán)境修復方式，其中生物修復技術(shù)具備污染少、效益高、投資低、風險小等優(yōu)勢，是公認的發(fā)展?jié)摿^大的環(huán)境修復方式，為解決復雜的環(huán)境污染問題提供了新思路。石油是一種復雜混合物，主要由鏈烷烴、芳香烴、環(huán)烷烴以及少量非烴化合物組成，是很多微生物的生長所需要的碳源，甚至有些微生物是將其作為唯一碳源。這些微生物能通過氧化反應(yīng)將石油烴轉(zhuǎn)化為低分子化合物被生物體利用合成自身細胞成分，一些也可以氧化成CO2和H2O，循環(huán)進入大氣。本課題的目的就是從自然海洋環(huán)境中篩選出能夠高效降解石油的菌株，從溫度、含油量、pH 值、菌液濃度等條件對這兩株菌進行研究，優(yōu)化參數(shù)條件，提高降解效果，最終為生物修復石油烴污染提供理論和技術(shù)參考。

一、材料與方法

（一）實驗材料的采集和處理

相關(guān)工作人員需要采集海水、海泥、海洋動物、藻類等樣品，然后立即裝到無菌采樣袋中，低溫保存送回實驗室及時處理。無菌稱取5g 樣品，放入無菌錐形瓶中，并倒入10 倍體積的無菌海水，旋渦振蕩，使其充分混勻制成懸濁液。

（二）菌種富集培養(yǎng)

無菌量取一種樣品的菌懸液10mL 加入裝有100mL 富集培養(yǎng)液的錐形瓶中，富集培養(yǎng)液包括三種：(Ⅰ)富集培養(yǎng)液Ⅰ(無機鹽培養(yǎng)液)：NaNO32g，K2HPO41.81g，MgSO4·7H2O0.1g；CaCl20.01g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，石油烴1%，pH 值為7；(Ⅱ)富集培養(yǎng)液Ⅱ(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，石油烴0.5%，pH 值為7；(Ⅲ)富集培養(yǎng)液Ⅲ(馬丁氏培養(yǎng)液)：0.03%孟加拉紅100mL，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，石油烴0.5%，pH 值為7；培養(yǎng)液和培養(yǎng)基均用陳海水配制，石油烴：柴油體積比1:4。在28℃環(huán)境下，連續(xù)振蕩培養(yǎng)7 天，之后取其上清液10mL，轉(zhuǎn)接入新鮮相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中。上述步驟需要被連續(xù)重復，直到完成富集培養(yǎng)2 次。以相同的方法富集培養(yǎng)其他樣品中的微生物。

（三）菌株純化

1.稀釋涂布平板法：將菌懸液于無菌海水中，按1 ∶9(V/V)比例稀釋，分別將稀釋度為10-3，10-4，10-5 的稀釋液，吸取20uL 注入PDA 平板和馬丁氏平板中，涂布，倒置培養(yǎng)7 天，接下來進行純化，直至獲得純培養(yǎng)，同時觀察記錄菌落特征和鏡檢。2.平板劃線分離法。稀釋涂布平板法效果不理想則考慮使用此種方法。

（四）菌株馴化

在富集培養(yǎng)液Ⅱ中增加石油烴的濃度，梯度為0.7%、0.9%、1.0%，加入菌液50uL 到盛有5mL 的試管中，30℃下振蕩培養(yǎng)7 天，振蕩頻率為160r/min。一個周期后將步驟重復，繼續(xù)30℃振蕩培養(yǎng)7 天。

（五）石油含量與降解率測定方法

1.采用紫外分光光度法測定石油含量。用石油醚作為石油萃取劑，用紫外分光光度計在200～300nm 處掃描，吸收峰出現(xiàn)在227nm 處，因此選用227nm 進行分析可提高實驗的準確性及靈敏度。2.菌種菌懸液的配制。觀察馴化結(jié)果，選取出降解較明顯的菌種。依次稀釋至適當濃度，然后將適當濃度的菌液滴加在細胞計數(shù)板上，進行計數(shù)。根據(jù)數(shù)值配制菌液濃度為2.6-3.0×108 個/mL。3.菌種降解率的測定。分別配制石油烴的濃度為0.5%、0.7%、0.9%的培養(yǎng)液Ⅱ和PDA 培養(yǎng)液，取1.0mL 分離馴化得到的效果較好的純菌株分別接入到含20mL 的上述培養(yǎng)液的100mL 的錐形瓶中，在30℃，160r/min 的條件下培養(yǎng)6d。同時，不加菌液做空白對照。

分別在錐形瓶中加入2.0mL 的硫酸(1:3)，2.0mL 的正己烷，然后全量轉(zhuǎn)入梨形分液漏斗（60mL）中，之后在漏斗中加入正己烷3.0mL，并振蕩2min(注意放氣)，最后靜置分層。待分層之后，將下層水樣放入原瓶中。漏斗頸內(nèi)的水分要用濾紙卷吸干。將正己烷萃取液放入比色管中，比色管容量為10mL，并帶刻度。振蕩原樣瓶，將萃取過的水樣倒回分液漏斗中，加入5.0mL 的正己烷重復萃取一次，將萃取液合并于帶刻度的比色管中，用正己烷定容至標線。

采用紫外分光光度法測定原樣中石油烴的含量。降解率計算公式：降解率(%)=(A0—A)/A0，A0——對照組測定殘油的吸光度值，A——待測樣中降解后殘油的吸光度值。

二、結(jié)果與分析

（一）初步鑒定：菌株F1 和F2 的鑒定

1.菌株F1 和F2 的菌落特征如下：

2.菌株顯微鑒定。在20 倍的顯微鏡下觀察兩個菌株兩次富集馴化培養(yǎng)后菌絲團的圖片如下：

從菌株F1 和F2 的初次、再次富集圖片可以看出這兩個菌株降解石油的能力是可以通過馴化逐步提高的。

在40 倍顯微鏡下得到菌株F1 和F2 的顯微照片，見下圖：

從圖2.7 中，可以看到真菌F1 的細胞結(jié)構(gòu)中有青霉的特征：孢子頂端膨起成掃帚狀。從圖2.8 中，可以看到芽枝孢子的特殊結(jié)構(gòu)：孢子不是平滑的，其頂端有芽。通過對比真菌青霉和芽枝孢子的結(jié)構(gòu)圖片，確定了這兩種真菌的屬類，F(xiàn)1 是青霉屬(Penicillium)，F(xiàn)2 是芽枝屬(Cladosporium)。

（二）降解石油烴的海洋真菌的降解能力分析

1.溫度。實驗溫度設(shè)定為16、22、28、34℃等4 個溫度梯度試驗組，160r/min，pH7，石油含量為0.7%，振蕩培養(yǎng)7 天，同時不加菌液做對照，7 天后測定降解率，觀察得知，兩株菌在15～35℃范圍內(nèi)都可以生長，溫度對微生物石油降解能力的影響較大，具體表現(xiàn)為兩株菌的石油降解能力在一定范圍內(nèi)與溫度呈正向相關(guān)。二者石油降解能力隨著升高而提升，當環(huán)境溫度達到28℃時達到最大值，隨著溫度的繼續(xù)升高，它們的石油降解率均有所降低。溫度超過34℃時，兩株菌的石油降解率和生長量均呈降低趨勢。因為，微生物生長代謝與溫度有關(guān)，當溫度高于34℃時，菌株的酶活性逐漸降低。另外，石油烴對微生物細胞膜的毒性也逐漸加劇，限制了石油烴的降解。

2.石油濃度。實驗選擇在石油含量為0.5%，0.7%，0.9%等3 個石油濃度梯度試驗組，28℃，160r/min，pH7，振蕩培養(yǎng)7 天，同時不加菌液做對照，7 天后測定降解率，可以看出，兩株菌在0.5～0.9%濃度范圍內(nèi)都可以生長，石油濃度對微生物石油降解能力有較大影響，在石油濃度為0.7%時，微生物石油降解能力最大。因為，作為該實驗中微生物生長所需的唯一碳源，石油濃度過低時不能滿足大量微生物生長代謝和繁殖的相關(guān)需求，會導致除油量減小。當石油濃度增大到適于微生物生長時，它們就會快速繁殖，繼而菌體數(shù)量增加，石油也被快速有效的分解利用，表現(xiàn)為除油量大幅度提高。而當石油濃度過高時，會對微生物生長代謝產(chǎn)生抑制作用，甚至殺死微生物細胞，對石油降解產(chǎn)生影響。

3.pH 值。實驗設(shè)定了石油降解培養(yǎng)基的pH 值為4、5、6、7、8 等4 個不同pH值梯度試驗組，石油含量為0.7%，28℃，160r/min，振蕩培養(yǎng)7 天，同時不加菌液做對照，7 天后測定降解率，可以看出，兩株菌在pH 值4～8 范圍內(nèi)都可以生長，pH 值對微生物的生長繁殖及其降解石油效率均產(chǎn)生了不同程度的影響，在pH 值為4-7這個范圍內(nèi)，降解率隨著pH 值增大而增大，當pH 值為7 時，降解率上升至最大。當pH 值大于7 時，微生物石油降解效率隨著pH 值上升而降低，說明堿性海水不適合這兩種菌株生長。

4.菌液濃度。選擇菌液濃度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%等6 個不同菌液濃度梯度試驗組，pH 值為7，石油含量為0.7%，28℃，160r/min，振蕩培養(yǎng)7 天，同時不加菌液做對照，7 天后測定降解率，分析結(jié)果可知，石油降解率隨菌液濃度增加而升高，當菌液濃度為2.5%時降解率達到最高，之后兩種真菌的降解率隨著菌液濃度提升而下降。由此可見，要利用微生物對石油進行有效的降解，必須將菌液濃度控制在合理范圍內(nèi)。因為，菌液濃度太小，菌體很難快速適應(yīng)新的生長環(huán)境，其生長期延長，不利于石油降解；反之，則造成碳源短缺，菌體之間競爭營養(yǎng)物質(zhì)，同樣不利于新生菌體的生長，從而影響石油降解。

三、結(jié)論

1.從海洋動植物體內(nèi)分離的微生物大多數(shù)具有降解石油烴的能力。2.分離出兩株真菌具有很好的降解石油烴的能力，分別為青霉屬(Penicillium)和芽枝屬(Cladosporium)，對石油烴的降解率達45%以上。3.從不同溫度、石油濃度、pH 值、菌液濃度4 個條件，探討和研究兩株真菌的降解效果，得出相對優(yōu)化的條件，相關(guān)的探討有待進一步深入研究。