西瓜藤鎮痛活性部位篩選及作用機制研究*

龔小妹，歐春麗，侯小利，張文玉，陳碩，周小雷，王碩

(1.廣西藥用植物研究所，西南瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，南寧 530021；2.山東省濟南市歷下區人民醫院中藥科，濟南 250000)

西瓜藤為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物西瓜(Citrulluslanatus)的藤莖。其作為農作物廢棄物，資源非常豐富，如不合理利用會造成資源浪費，還會給環境造成壓力。開展其藥用價值研究，對開發新的藥用資源，實現中藥資源可持續發展具有重要意義[1]。筆者前期研究發現，西瓜藤總提取物具有較好抗炎鎮痛活性[2-6]，但其鎮痛作用活性部位及機制尚不明確。在前期研究基礎上，筆者采用2.5%甲醛溶液致小鼠足下疼痛實驗研究西瓜藤鎮痛活性部位，并研究西瓜藤鎮痛活性部位的鎮痛作用機制，以期為西瓜藤的進一步開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康昆明種小鼠，雌雄各半，體質量(20±2)g，無特定病原體(SPF)級，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(桂)2014-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK(桂)2014-0003。飼養條件：小鼠分籠飼養，自由飲食，飼養室溫度(23±2) ℃，相對濕度(60±5)%，光暗周期同晝夜周期。

1.2藥物 西瓜藤采自廣西壯族自治區南寧市吳圩，經廣西藥用植物研究所趙以民副研究員鑒定，為葫蘆科植物西瓜CitrullusLanatus的藤莖；吲哚美辛片(山西云鵬制藥有限公司生產，批號：A120708)。

1.3試劑 β-內啡肽(beta-endorphin，β-EP)、5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)、一氧化氮(NO)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、P物質(substance P，SP)和去甲腎上腺素(noradrenaline，NE)等試劑盒由武漢華美生物工程有限公司生產，批號分別為D27014434、C32025571、D27011128、C051024113、B051125119、D27013145；總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，批號：O3527)；2.5%甲醛溶液(甲醛含量37.0%～40.0%，西隴化工股份有限公司，批號：1305051)；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(天津市富宇精細化工有限公司生產，批號分別為110930，1208291，1305181，110825)。

1.4主要儀器 SB-1100水浴鍋、N-1106旋轉蒸發儀、EYELA-CA-1111循環冷凝真空泵(上海愛明儀器有限公司)；HX502T電子天平(慈溪市天東衡器公司，感量：0.1 mg)；Tecan Infinite F200酶標儀(瑞士帝肯Tecan)；BIO-RAD基礎電泳儀(北京市六一儀器廠)；離心機(德國艾本德生命科學公司，型號：Centrifuge 5430R)。

1.5西瓜藤提取物的制備 取西瓜藤干品5 kg，粉碎，分別用藥材量的10和8倍水煮沸提取2和1.5 h，合并提取液，濃縮干燥，即得西瓜藤水部位提取物(浸膏0.8 kg)。取西瓜藤干品20 kg，粉碎，用藥材量的5倍80%乙醇分別超聲處理2和1 h，濾過，減壓濃縮得醇提取浸膏2.4 kg(每克浸膏相當于生藥8.3 g)，將浸膏分散于去離子水5000 mL，靜置過夜，3000 r·min-1離心(r=10 cm)，分離不溶于水的黏稠固體懸浮物。取水溶液，依次用3倍量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取樣品，得石油醚部位提取物浸膏(0.12 kg)、乙酸乙酯部位提取物浸膏(0.13 kg)、正丁醇部位提取物浸膏(0.40 kg)[5]。

1.6致痛實驗 取健康昆明種小鼠110只，雌雄各半，采用隨機分組法分為11組，每組10只，分別為吲哚美辛組[吲哚美辛片，0.009 g·kg-1·d-1，于實驗前將吲哚美辛片用研缽粉碎，過孔徑0.075 μm(200目)篩，按成人每天每次使用69.23 mg換算成小鼠給藥劑量，0.9%氯化鈉溶液溶解，配成0.9 mg·mL-1混懸液，按0.2 mL·(20 g)-1·d-1灌胃]，空白對照組和模型對照組[給予0.9%氯化鈉溶液，按0.2 mL·(20 g)-1·d-1灌胃]，西瓜藤石油醚部位提取物大劑量、小劑量組(給藥劑量相當于生藥20.0，5.0 g·kg-1·d-1)，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物大劑量、小劑量組(給藥劑量相當于生藥20.0，5.0 g·kg-1)，西瓜藤正丁醇部位提取物大劑量、小劑量組(給藥劑量相當于生藥20.0，5.0 g·kg-1·d-1)，西瓜藤水部位提取物大劑量、小劑量組(給藥劑量相當于生藥20.0，5.0 g·kg-1·d-1)。空白對照組左后足跖皮下注射0.9%氯化鈉溶液，其他各組給藥前左后足跖皮下注射2.5%甲醛溶液30 μL，計時，立即置平底大玻璃容器，記錄給藥前小鼠注射2.5%甲醛溶液后1～5 min(Ⅰ相)和15～35 min(Ⅱ相)內痛反應累積時間，評分。1周后，空白對照組和模型對照組灌胃0.9%氯化鈉溶液，0.2 mL·(20 g)-1，其他各組灌胃相應藥物，連續7 d。末次給藥后1 h，空白對照組左后足跖皮下注射0.9%氯化鈉溶液，其他各組左后足跖皮下注射2.5%甲醛溶液30 μL，立即置平底大玻璃容器，分別記錄小鼠注射2.5%甲醛溶液后1～5 min(Ⅰ相)和15～35 min(Ⅱ相)內痛反應累積時間，評分。評分方法：第一部分為注射2.5%甲醛溶液抬起足時間，第二部分為注射2.5%甲醛溶液舔、咬、抖動足時間，將給藥前后評分值代入公式1分別計算各組累積分值，由公式2得出給藥后鎮痛評分值。公式1：累積分值=(第一部分時間×1+第二部分時間×2)/300；公式2：鎮痛評分值=(給藥后累計分值/給藥前累計分值)×100%[7]。

1.7小鼠血清炎癥遞質測定 取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，采用隨機分組法分為6組，每組10只，分別為空白對照組和模型對照組[0.9%氯化鈉溶液，0.2 mL·(20 g)-1·d-1]，吲哚美辛組(吲哚美辛片，0.009 g·kg-1·d-1，配制方法同“1.6”項)，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物大劑量、中劑量、小劑量組(給藥劑量相當于生藥20.0，10，5.0 g·kg-1·d-1)，均連續灌胃給藥7 d。末次給藥后1 h，除空白對照組外，其他各組小鼠左后足跖皮下注射2.5%甲醛溶液30 μL，15 min后經眼球取血，3500 r·min-1離心15 min(r=10 cm)，取上清液檢測血清NO、PGE2、5-HT、β-EP、SP與NE含量。

1.8小鼠腦內環氧合酶測定[8]

1.8.1動物分組與模型的制備 取健康昆明種小鼠288只，雌雄各半，隨機分組法分為6組，每組48只。給藥方法同“1.7”項。連續給藥7 d，末次給藥后1 h，各組分別取小鼠6只，雌雄各半，處死并取大腦，記為Beffer時間點；剩下各組小鼠，除空白對照組外，其他組小鼠左后足跖皮下注射2.5%甲醛溶液30 μL以誘導炎性痛。并在注射2.5%甲醛溶液后1，2，3，4，5，6，7 d，各組(包括空白對照組)分別取小鼠6只，雌雄各半，處死并取大腦，記為1，2，3，4，5，6，7 d時間點。

1.8.2cDNA第一鏈合成 在“1.8.1”項中各時間點取的小鼠大腦，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA，cDNA第一鏈合成試劑盒把總RNA合成cDNA。

1.8.3反轉錄聚合酶鏈反應分析 將合成cDNA進行聚合酶鏈反應。聚合酶鏈反應所用引物：GAPDH(5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，5′-TACAGCAACAGGG-TGGTGGA-3′；產物長度307 bp)，COX-1(5′-AGGA-GATGGCTGCTGAGTTGG-3′，5′-AATCTGACTTTCTGA-GTTGCC-3′，產物長度602 bp)，COX-2(5′-GGGAA-GCCTTCTCCAACC-3′，5′-GAACCCAGGTCCTCGCTT-3′，產物長度293 bp)。反應條件95 ℃ 2 min，隨即30個循環聚合酶鏈反應，循環溫度方案：95 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃1 min。循環結束后，72 ℃溫育10 min，聚合酶鏈反應所得產物經加有溴化乙錠(ethidium bromide，EB)的瓊脂糖電泳，凝膠成像儀進行圖像分析。用Quantity One軟件測條帶的灰度值(integrated density value，IDV)，計算出相對IDV。相對IDV=目的基因IDV/內參GAPDH IDV。觀察西瓜藤鎮痛活性部位對小鼠腦內COX-1、COX-2表達的影響。

2 結果

2.1小鼠疼痛評分 見表1。與模型對照組比較，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物大劑量、小劑量組和吲哚美辛組小鼠給藥后Ⅰ相、Ⅱ相累計分值和鎮痛評分值均顯著降低(P<0.05)。其他各組鎮痛作用不明顯。因此選擇西瓜藤乙酸乙酯部位提取物作為有效鎮痛部位進行鎮痛機制研究。

表1 各組小鼠疼痛評分結果

2.2小鼠血清炎癥因子測定結果 見表2。與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清NO、PGE2、5-HT、SP、NE含量均顯著升高(P<0.05)，β-EP含量顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，大劑量西瓜藤乙酸乙酯部位提取物可降低2.5%甲醛溶液致痛小鼠血清P物質含量(P<0.05)；大劑量、中劑量西瓜藤乙酸乙酯部位提取物能顯著升高2.5%甲醛溶液致痛小鼠血清β-EP含量(P<0.05)，降低血清NO、PGE2、5-HT、NE含量(P<0.05)。

表2 6組小鼠血清NO、PGE2、5-HT、β-EP、SP、NE含量測定結果

2.3小鼠腦內環氧合酶變化 與空白對照組比較，模型對照組致痛前(0 d)腦內COX-1與COX-2表達均無明顯變化，致痛后1～4 d腦內COX-1表達較弱，COX-2表達逐漸增強；5～7 d腦內COX-1表達逐漸增強，COX-2表達逐漸減弱。與模型對照組比較，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物各劑量組和吲哚美辛組致痛前(0 d)腦內COX-1與COX-2表達均無明顯變化；西瓜藤乙酸乙酯部位提取物大劑量組和吲哚美辛組小鼠致痛后1～4 d腦內COX-2表達被明顯抑制，5～7 d腦內COX-1表達被明顯抑制，見圖1～3。

3 討論

疼痛是機體受到內、外環境刺激后，組織釋放致痛物質并傳導至感覺中樞，最終進入意識階段的一個非常復雜的過程，嚴重影響患者身心健康。目前臨床上對疼痛的治療主要以西藥為主，按作用機制可分為中樞鎮痛藥和外周鎮痛藥兩類。中樞鎮痛藥主要以阿片生物堿類藥嗎啡為代表，但易產生成癮性與耐藥性；外周鎮痛藥主要以解熱鎮痛類藥對乙酰氨基酚、阿司匹林等為代表，但常伴隨胃腸道反應、變態反應、凝血障礙等不良反應，因此開發療效可靠、不良反應少、無依賴性的中藥或天然鎮痛藥物已成為當前鎮痛藥物研究熱點[9-10]。

由于疼痛機制復雜，選擇與臨床疼痛癥狀相似的動物模型揭示鎮痛藥作用機制十分必要[11-12]。2.5%甲醛溶液致痛小鼠模型是目前國際公認的研究藥物鎮痛作用的主要模型，其導致的疼痛可分為兩期，第一期為直接刺激神經末梢引起的疼痛，第二期為炎癥遞質(如NO、β-EP、5-HT、PGE2、SP、NE等)產生并釋放所致[11-12]，當機體受到炎性痛刺激時，PGE2作為重要的炎癥遞質，激活傷害性感受器，導致痛覺過敏，進一步發動和傳遞痛覺信號[13]，β-EP可以通過激動阿片受體從而引起抗傷害性感受或鎮痛作用[14]，SP能夠在神經末梢釋放并參與疼痛在脊髓中樞的傳導和調制[15]，同時產生過多的NO，促進疼痛傳導，增加致痛遞質的釋放[16]，5-HT作為一種致痛因子借助第二信使刺激局部和旁分泌并在感覺神經末梢釋放而導致疼痛[17]。作為交感神經遞質，NE的異常升高與疼痛有密切關系[18]。COX是PGs合成過程中的重要限速酶，其同工酶有COX-1和COX-2，COX-2在疼痛急性早期起重要作用，COX-1與疼痛后期維持有關[19-21]。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.吲哚美辛組；D.西瓜藤乙酸乙酯提取物大劑量組；E.西瓜藤乙酸乙酯提取物中劑量組；F.西瓜藤乙酸乙酯提取物小劑量組。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.吲哚美辛組；D.西瓜藤乙酸乙酯提取物大劑量組；E.西瓜藤乙酸乙酯提取物中劑量組；F.西瓜藤乙酸乙酯提取物小劑量組；①與空白對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.吲哚美辛組；D.西瓜藤乙酸乙酯提取物大劑量組；E.西瓜藤乙酸乙酯提取物中劑量組；F.西瓜藤乙酸乙酯提取物小劑量組；①與空白對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05。

研究表明[22-23]，中藥鎮痛作用主要通過提高中樞阿片肽、5-HT、NO水平，阻斷中樞性鈣通道，抑制前列腺素合成，減少腦組織興奮性氨基酸含量，以及通過減少外周致痛物質分泌等發揮作用。本研究顯示，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物能顯著降低2.5%甲醛溶液致痛模型小鼠Ⅰ相、Ⅱ相鎮痛評分值，降低外周致痛物質NO、PGE2、5-HT、SP、NE含量，升高β-EP含量；同時能抑制2.5%甲醛溶液致痛后小鼠大腦內COX-1與COX-2表達，可見西瓜藤乙酸乙酯部位提取物可通過中樞和外周兩方面發揮較好鎮痛作用，本實驗結果可為將西瓜藤開發成新型中藥鎮痛新藥提供參考，也為農作物廢棄物的合理再利用提供新思路。