酶促反應芯片研究堿性磷酸酶的酶促反應

查春旺 吳劍 王成飛

摘 要：本文采用具有自主知識產權的酶促反應教學微芯片為基礎結合新型層析裝置，對堿性磷酸酶的酶促反應及其產物進行了初步摸索。通過該芯片可以較為方便的摸索相關反應的不同反應條件，方便進行最佳反應速度、溫度等的摸索，結合新型色譜層析裝置可以分離和分析反應的產物。相關設備便攜性好，可用于相關知識點的教育教學，同時考慮到酶促反應在人體中的重要地位，本裝置在生物制藥、生物工程、醫藥衛生等領域也有廣泛的應用前景。

關鍵詞：酶促反應教學微芯片;堿性磷酸酶;色譜層析

堿性磷酸酶酶促反應實驗是生化實驗中經典的反應，但是該實驗操作過程較為復雜，使得相關實驗只能在實驗室進行。我們將微流控芯片這一分析化學的熱點技術[1-3]，引入教學領域發展了教學微芯片，并進一步發展了酶促反應教學微芯片[4]該芯片可以一次性生成多個不同條件，結合我們發展的新型色譜層析裝置[5]，對上述反應的產物進行分析，可以發現這兩個裝置的結合可以很好的對相關反應進行研究，相關設備便攜性好，可用于相關知識點的教育教學，同時考慮到酶促反應在人體中的重要地位，本裝置在生物制藥、生物工程、醫藥衛生等領域也有廣泛的應用前景。現報道如下：

1 ?實驗部分

1.1 ?試劑、用品和儀器

陶瓷加熱片、PID溫度控制裝置、Pt100感溫探頭、液冷風扇、水晶膠、食品級硅橡膠、D1500型自動光刻機、配套光刻板（聊城科天激光設備有限公司）、小青龍牌食品級硅膠（A、B膠1：1混合）、小青龍牌水晶膠（快干型A、B膠2：1混合）、收音機伸縮天線，品牌： HW（初始長度127mm拉伸320mm天線）（均購自淘寶）。薄層層析硅膠，天津光復精細化工研究所。

1.2 酶促反應芯片制備

采用本課題組的專利技術制備[4]，過程包括coredraw軟件設計芯片結構，光刻機光刻制備相關的管道模板，按A：B=1：1比例混合食品硅膠A、B膠獲得前聚體澆筑到上述

陽模上待其固化，剝離獲得食品硅膠陽模，按A：B=3：1混合水晶膠A、B膠獲得前聚體澆筑到上述陽模表面待其固化，剝離得到水晶膠管道芯片，制備上蓋片，按需要封合芯片即可。

圖1為芯片實物，從中間的兩個進水口1、2注射后兩端的出口處即可不同濃度的溶液，在不同的出口處分別用控溫元件進行溫度控制，即可形成不同條件的反應池。

1.3 色譜層析裝置

該裝置按照文獻[5]制備，同樣使用食品級硅膠和水晶膠制備，使用coreldraw軟件設計的結構是具有凸棱的頂蓋模型和類似手的結構的底座模型。將四個伸縮天線通過熱溶膠分別固定、安裝在頂蓋和底座邊緣，連接二者，且保證頂蓋的貫通槽與底座的凹槽相對應，完成器件制作。

1.4 堿性磷酸酶酶促反應條件摸索

在實驗時將一定濃度的堿性磷酸酶注射入兩端的在反應池中，底物磷酸苯二鈉溶液和水溶液分別從芯片的進樣口1、2注入，在反應池中形成不同的濃度，通過芯片兩端反應池的控溫元件控制反應溫度，可以摸索不同溫度不同底物濃度對該反應的影響，可在反應池中加入該反應的抑制劑Na2HPO4觀察抑制劑對反應的影響。

所有反應池均在15分鐘后加入0.5mol/L NaOH 0.1 ml以中止反應。然后在各反應池中加入0.3%的4-氨基安替比林0.1 ml及0.5%鐵氰化鉀0.2 ml，充分混勻，放置10分鐘以將生成的苯酚反應成紅色的醌類。

用毛細管蘸取上述各池的反應物，點在薄層板上，將薄層板放入上述制備的薄層層析裝置中，按需要一個裝置可同時進行5-10組的薄層層析，通過比較層析板上紅色斑點（苯醌）的顏色深淺可以了解反應進行的程度。

2 結果與討論

不同溫度下控制相關反應，在37oC，生成的苯醌斑點顏色最深，該反應的最適合溫度為37oC。如通過ImageJ軟件對斑點進行分析，可得底物濃度和酶促反應的關系，結果符合米氏方程。在反應池體系中加入的Na2HPO4抑制劑可以明顯的降低紅色斑點的顏色。

3 ?結論

本文綜合應用具有自主知識產權的酶促反應微芯片和新型色譜層析裝置，進行了堿性磷酸酶酶促反應條件的摸索，該聯合裝置具有一定的便攜性，反應結果比較明顯，由于采用酶促反應芯片節約了實驗試液的配制時間，也很方便控制不同反應池的溫度和抑制劑等多種條件，因此可以快速的對相關反應進行研究，其可以應用在課堂教學中，同時堿性磷酸酶廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸組織是非常重要的酶類，對其進行快速檢測顯然具有重要的意義，因此本裝置未來在生物制藥、生物工程、醫藥衛生等領域也有廣泛的應用前景。

參考文獻：

[1]王國陽，白志晨，王佳慧，蘇波，張存林.光譜學與光譜分析，2021，41（06）：1678-1682.

[2]夏韜然，鄒偉，劉晶.生物工程學報：1-10[2021-06-16].https：//doi.org/10.13345/j.cjb.210025.

[3]李瑋瑋，李雨軒，林金明.分析測試學報，2021，40（06）：822-827.

[4]查春旺，吳劍，朱丹，海瀟雅，劉慧敏，張思雨，程永婷. 一種酶促反應教學微芯片[P]. 安徽省：CN211586660U，2020-09-29.

[5]吳劍，王成飛，孟嬋嬋，唐玲，王文東，馬雨婷，蔣歡. 一種色譜層析教具及其制備方法[P]. 安徽省：CN109490463A，2019-03-19.

通訊作者：吳劍。

基金項目：安徽省教育廳教學研究重點項目（2019jyxm0552），安徽省教育廳高校自然科學研究重點項目（KJ20180795），安徽中醫藥高等專科學校校級項目（ZRKXY201910）。