液相色譜一串聯質譜法測定血清中尿素含量

唐強

摘 要：針對傳統血清中尿素含量測定方法操作困難，準確度低的問題，提出液相色譜一串聯質譜法測定尿素中血清含量。分別對兩種濃度水平下水清中尿素濃度定值，精準測試盲樣中尿素含量。全面分析了影響血清中尿素含量的因素，并根據分析結果對其不確定度進行評價。結果表明：液相色譜一串聯質譜法測定血清中尿素含量相對偏差（RSD）均小于1%。對兩種濃度水平的血清進行測定，不確定度分別為1.2%和0.84%，這就證明本文所建立的方法測量血清中尿素含量比較準確，且原理比較可靠，定量比較準確，前處理簡單，可以當做血清中尿素含量測定的候選參考方法。

關鍵詞：血清;尿素;同位素稀釋質譜法;液相色譜

中圖分類號：R446.1 文獻標識碼：A ? ? 文章編號：1001-5922（2021）10-0033-04

Determination of Urea in Serum by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Tang Qiang

（Hunan College of Foreign Studies， Changsha 410116， China）

Abstract：Aiming at the problems of difficult operation and low accuracy of traditional methods for the determination of urea in serum， a liquid chromatography tandem mass spectrometry method was proposed to determine the content of urea in serum. Determine the concentration of urea in the water at two concentration levels， and accurately test the urea content in the blind sample. The factors affecting the content of urea in the serum were comprehensively analyzed， and the uncertainty was evaluated based on the analysis results. The results showed that the relative deviation （RSD） of urea content in serum determined by liquid chromatography tandem mass spectrometry was less than 1%. The uncertainty of urea in two concentrations of serum was 1.2% and 0.84% respectively， which prove that the method established in this paper is more accurate in measuring serum urea content， and the principle is more reliable， the quantification is more accurate， and the pretreatment is simple， it can be used as a candidate reference method for the determination of urea content in serum.

Key words：serum; urea; isotope dilution mass spectrometry; liquid chromatographypounds

尿素是人體內氨基酸分解代謝的產物，受肝臟功能和蛋白質攝入量影響。在臨床醫學中，尿素代謝是反映腎功能情況的非特異性性指標，也是在正常人普通飲食的情況下，一項較為敏感的指標。因此，準確檢測血清中尿素含量是臨床醫學中，非常重要的一項研究。目前較為常見的血清中尿素測定方法有脲酶速率法[1]、離子電導法[2]、二乙酰肟法[3]，這些方法雖然能夠檢測出血清中尿素的含量，但精準度還需要進一步提高。針對以上方法存在的問題，張鵬[4]提出氣相色譜/同位素稀釋質譜法，為病人血清提供了一個高度準確的測定工具。但該方法存在測試過程困難，衍生化試劑使用條件嚴格，衍生化反應所需時間長，步驟繁瑣的問題，使得尿素的測定出現新的難題。基于此，文章嘗試對氣相色譜/同位素稀釋質譜法進行改進，將液相色譜作為分離系統，以串聯質譜作為檢測系統，對血清中尿素含量進行測定，并對其不確定度因素進行分析，為血清中尿素含量測定提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

本試驗主要材料為：人血清干粉（上海極威生物科技有限公司，GR）、尿素標記物（內蒙鄂爾多斯聯合化工，純度>99%）、尿素純品標準物質（國家標準物質研究中心，純度99.9%，不確定度0.2%，k=2）、甲醇（武漢強松精細化學品有限公司，高效液相色譜級）、乙腈（泉州市一海三路科技有限公司，高效液相色譜級）。

本試驗主要設備為：電子天平（濟南好來寶醫療器材有限公司，BSA124S）、超低溫冰箱（濟南鑫貝西生物技術有限公司，BDF-86V50）、移液器（河北慧采科技有限公司，C9722）、旋渦振蕩器（濟南愛來寶儀器設備有限公司，88882010）、液相色譜一串聯質譜儀（上海佐明機械設備貿易有限公司，6410B）。

1.2 試驗原理

試驗主要使用液相色譜一串聯質譜聯用技術（LC-MS/MS）檢測血清中尿素含量。將液相色譜作和串聯質譜分別作為分離系統和檢測系統。在分析血清中尿素含量時，提前對血清樣品進行相關處理，然后將其導入液相色譜部分，讓處理過的血清樣品在液相色譜中完成流動相分離的過程。樣品被離子化后，經過質譜的質量分析器按質量數將離子碎片分開，然后再由檢測器得到質譜圖[5]。液相色譜一串聯質譜聯用技術在熱不穩定化合物的分析測定、機型化合物的分析測定、不揮發性化合物分析測定和大分子量化合物的分析方面進行測定。液相色譜一串聯質譜聯用技術具體組成如圖1所示[6]。

1.3 試驗方法

1.3.1 血清樣品的制備

（1）從超低溫冰箱中取出經過處理的血清樣品，在室溫條件下靜置，待其達到平衡。將5ml高純三次水與血清干粉混合均勻，稱量記錄水的質量。

（2）將一定體積的13C和15N2尿素標記物放入待測樣品中，13C和15N2的加入量需要根據尿素濃度確定。加入標記物后，其余尿素含量比值大約為1∶1。準確稱量血清重量并記錄。

（3）將血清震蕩混合均勻后，置于室溫環境下平衡1h，加入血清1/3體積的乙腈試劑，混合均勻靜置，等待蛋白質沉淀后，將上層清液取出，用乙腈試劑將上層清液稀釋至1μg/g后，用有機相濾膜進行過濾，用ID-LC/MS/MS進行分析。尿素測量條件如表1、表2所示[7-8]。

1.3.2 分析過程

（1）將4個校準比值混合溶液進行進樣，進樣順序為從低標到高標。對混合溶液中尿素含量進行測定，每個標準進行3次平行試驗，取其平均值為最終結果。將尿素和尿素標記物質量比值作為評定標準，根據RSD確定其準確度，若結果RSD大于1%，則該結果不可用，試驗數據舍去，全部重新開始。將尿素與尿素標記物質量比對峰面積作圖，考查曲線線性回歸方程平方，根據考察結果判斷其準確度，若考查結果比0.999小，則試驗數據舍棄，重新進行試驗。

（2）血清樣品和其對應校準比值混合溶液一起進行分析測定，進樣次序為樣品摻雜在高低標之間，若結果RSD大于1%，則該結果不可用，試驗數據舍去，全部重新開始。進行3次平行試驗，將平均值作為最終結果。

2 結果與討論

2.1 血清測定結果

表3、表4分別為兩種濃度血清（血清A和血清B）括號法動量測試結果。以此結果進行不確定度的分析。

2.2? 不確定度分析

通過計算公式可以知道影響血清中尿素含量測試結果的因素，主要由隨機因素和系統因素構成。在此對影響血清中尿素含量因素的影響進行詳細分析。

2.2.1 隨機因素不確定度分析

隨機因素產生的不確定度主要是由測量變動引起的，因此可用測量結果標準偏差表示隨機因素不確定度，為簡化計算過程，這里的標準偏差為相對標準偏差[9-10]。

2.2.2非隨機因素不確定度分析

（1）稱量的不確定度。在分析過程中，主要有校準物、校準溶液、標記物、標記物溶液、血清樣品稱量，在稱量的過程中，都有可能造成一定不確定度。

工作標記物溶液和工作校準溶液的稱量比100mg高，電子天平最大不確定度為0.05mg，則工作標記物和校準溶液相對不確定度為0.05/100=0.05%;純品校準物重量比20mg多，天平最大不確定度為5.0μg，則純品校準物不確定度為0.005/20=0.025%;標準儲備液重量大于1g，天平不確定度為0.05mg，則標準儲備液不確定度為0.005/100=0.005%;血清樣品重量超過100mg，天平不確定度為0.05mg，則血清樣品不確定度為0.05/300=0.17%。

（2）校準物純度不確定度。由標準物質證書給出校準物質純度不確定度。

2.3? ?不確定度計算

2.3.1 尿素測定不確定度

（1）校準標準物質純度帶來的不確定度UB1。尿素標準物質為GBW09201，濃度、標準物質不確定度和標準不確定度分別為99.9%，0.2%和0.1%（由國家標準物質研究中心給出）。

（2）天平稱量帶來的不確定度UB2。天平稱量帶來的不確定度與稱量的不確定度一致。用2點校準法對該不確定度進行確定，在本研究中，所有天平稱量皆為對不確定度最大貢獻合成，則該工作校準溶液貢獻為3次，工作標記物貢獻為4次。天平稱量不確定度為：

（3）隨機因素不確定度 UA。隨機因素帶來的不確定度由測量結果相對標準偏差表示，具體計算為：

血清中尿素A：

其擴展不確定度為：U=k×uc=0.59%×2≈1.2%

血清中尿素B：

其擴展不確定度為：U=k×uc=0.42%×2≈0.84%

2.4 對比樣品定值結果

由上述公式計算結果，確定樣品定值結果為：

血清中尿素-水平A：556.45μg/g，不確定度為1.2%，K=2。

血清中尿素-水平B：1123μg/g，不確定度為0.84%，K=2。

3 結論

試驗采用13C，15N2-尿素為內標，乙腈為沉淀蛋白， 建立了液相色譜-同位素稀釋串聯質譜法測定血清中尿素含量。以兩種濃度水平的血清樣品為指標進行定值，測定盲樣中血清含量，分析了盲樣測定結果中的不確定度。結果表明，兩種水平血清中尿素不確定度分別為1.2%和0.84%，相對標準偏差（RSD）均不大于1%，證實了文章建立的液相色譜-同位素稀釋串聯質譜法的可靠性。

參考文獻

[1]趙勇，曾瑋榮，余福安，等.不同模式檢測尿素水平對透析充分性評估的影響[J].臨床輸血與檢驗，2021，23（01）：91-95.

[2]于勁松，徐斐，曹慧，等.電導率法篩選鎘離子印跡聚合物功能單體[J].工業微生物，2020，50（03）：43-48.

[3]胡娟，李珂.二乙酰單肟法測定微量尿素的方法改進[J].大氮肥，2021，44（02）：135-136+140.

[4]張鵬，張倩，鐘華，等.鄰苯二甲醛對還原型谷胱甘肽的光譜分析——推薦一個儀器分析實驗[J/OL].大學化學：1-7[2021-08-12]

[5]武帥. 人血清中尿素的測定研究[J].粘接，2021（07）：29-33.

[6]張娟麗，于婷，沈敏，等.血清中尿酸及尿素測定能力驗證研究[J].中國醫學裝備，2021，18（04）：40-44.

[7]羅文依，杜琴，汪光蓉，等.基于中西醫特異臨床指標的系統性紅斑狼瘡的抗Sm抗體蛋白的研發[J].中藥藥理與臨床，2021，37（01）：211-216.

[8]王權成，吳文龍，張玄，等.人外周血單個核細胞分泌細胞因子對α-1，3-半乳糖基轉移酶基因敲除豬肝細胞的作用[J].中華移植雜志（電子版），2020，14（03）：182-187.

[9]魏寧，季師敏，劉鋼，等.運動血清對海馬HT-22細胞突觸形成及BDNF、TrkB蛋白表達的影響[J].遼寧體育科技，2020，42（06）：52-56.

[10]宗利強，李巍，沈萬鵬，等.5種腺病毒通用型抗原表位融合蛋白的設計制備及檢測試劑的研發[J].藥物生物技術，2021，28（03）：227-232.