頭孢菌素C產(chǎn)生菌的誘變育種及發(fā)酵應(yīng)用

牛李杰，張 婷，黨建寧，張寶新

(伊犁川寧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 伊寧 835000)

頭孢菌素C(Cephalosporin C)，全稱7-(D-5-氨基-5-羧基戊酰胺基)頭孢霉烷酸，是一種親水性的β-內(nèi)酰胺類抗生素，主要作為7-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA)的合成中間體[1]。頭孢菌素C通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽的合成起到抑菌作用，具有抑菌范圍廣、對(duì)人體毒性較小等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。

頭孢菌素C的產(chǎn)生菌為頂頭孢霉(Cephalosporiumacremonium)，生長(zhǎng)較慢，在發(fā)酵過程中容易出現(xiàn)抗性丟失、菌種退化的現(xiàn)象，因此需要不斷進(jìn)行自然和誘變選育來保證菌種的優(yōu)良性能，防止菌種衰退[4]。為了選育出性能優(yōu)良的菌株，常采用紫外誘變、微波誘變、化學(xué)誘變等方法，但是微生物突變生理生化反應(yīng)復(fù)雜，通過單一誘變往往難以達(dá)到目標(biāo)。因此，誘變育種多采用復(fù)合誘變法，即組合兩種或者兩種以上化學(xué)或其它誘變劑使菌株發(fā)生較大的突變，進(jìn)而篩選出優(yōu)良菌株來提高效價(jià)[5]。曹棟等[6]通過紫外誘變結(jié)合終產(chǎn)物抗性的方法篩選到的突變菌株RM-8的頭孢菌素C效價(jià)比出發(fā)菌株提高了45%。任璐[7]通過紫外誘變篩選到銅離子、丙二酸、頭孢菌素C-鈉鹽耐受的突變菌株，并驗(yàn)證了耐受突變菌株與高產(chǎn)突變菌株有一定的聯(lián)系，從耐受突變菌株中更容易得到高產(chǎn)突變菌株。孟國(guó)慶等[8]通過物理化學(xué)復(fù)合誘變的方法篩選到的高產(chǎn)菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵后，頭孢菌素C效價(jià)達(dá)到2.83 g·L-1，比出發(fā)菌株提高了154.6%。黎亮等[9]對(duì)頂頭孢霉進(jìn)行了紫外-氯化鋰復(fù)合誘變處理，并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，在160 t發(fā)酵罐中培養(yǎng)高產(chǎn)菌株，其效價(jià)比出發(fā)菌株提高了22.6%以上。

作者采用紫外線和丙二酸復(fù)合誘變的方法篩選頭孢菌素C高產(chǎn)菌株，并對(duì)篩選出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行50 L發(fā)酵罐小試驗(yàn)證，為后期中試及工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種和數(shù)據(jù)支持，對(duì)豐富菌種資源和提高生產(chǎn)效率具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

頂頭孢霉(Cephalosporiumacremonium)B-1822-S-04，保存于伊犁川寧生物技術(shù)股份有限公司。

PDA培養(yǎng)基(g·L-1)：馬鈴薯浸粉5.0，葡萄糖20.0，硫酸銨15.0，瓊脂15.0，自然pH值。

種子搖瓶培養(yǎng)基(g·L-1)：黃豆粉28.0，酵母浸膏28.0，玉米漿19.0，蔗糖30.0，葡萄糖10.0，碳酸鈣5.0，pH值7.00±0.05。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基(g·L-1)：花生粉28.0，酵母浸膏30.0，黃豆粉35.0，玉米漿15.0，玉米粉20.0，硫酸銨1.0，碳酸鈣15.0，消泡劑1.4，pH值7.20±0.05。

15 L一級(jí)種子罐培養(yǎng)基(g·L-1)：黃豆粉29.0，花生粉28.5，蔗糖25.0，碳酸鈣5.0，玉米漿50.0，葡萄糖10.0，消泡劑0.35，pH值7.8，121 ℃滅菌35 min。

50 L二級(jí)種子罐培養(yǎng)基(g·L-1)：黃豆粉29.0，花生粉28.5，蔗糖8.0，豆油10.0，碳酸鈣6.5，硫酸銨2.5，硫酸鎂2.0，葡萄糖24.5，淀粉20.0，玉米漿60.0，消泡劑0.35，pH值6.0，121 ℃滅菌35 min。

50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g·L-1)：花生粉17.0，谷朊粉14.0，玉米粉11.0，糊精20.0，蛋氨酸15.0，硫酸銨8.0，豆油53.0，玉米漿100.0，硫酸鈣9.0，碳酸鈣5.0，消泡劑0.25，pH值6.8，121 ℃滅菌35 min。

1.2 儀器

30W/5A型紫外燈，上海四通特種燈泡廠；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海比朗儀器制造有限公司；ZWY-2102型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；SB-C18型高效液相色譜儀，安捷倫；CX31型顯微鏡，奧林巴斯；WS-500YDA型滅菌鍋，濟(jì)南寧樂醫(yī)療器械有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海盛磁儀器有限公司；PL3002型電子天平，瑞士梅特勒-托利多；PHCBI型超低溫冰箱，日本三洋；50 L型六聯(lián)發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

刮取活化培養(yǎng)的菌株B-1822-S-04孢子，與0.9%無菌生理鹽水混合，置于旋渦振蕩器上振蕩20 s使孢子混合均勻，用雙層無菌脫脂棉紗布過濾，得菌懸液，適當(dāng)稀釋控制孢子濃度約為106個(gè)·mL-1。

1.3.2 致死率和正突變率的測(cè)定

統(tǒng)計(jì)誘變處理平板上的菌落數(shù)，以未經(jīng)誘變處理平板上的菌落數(shù)作為對(duì)照，按下式計(jì)算致死率：

1.3.3 效價(jià)的測(cè)定[10-11]

按1.3.1方法制備菌懸液，經(jīng)種子和發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)后，將發(fā)酵液于3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用0.44 μm過濾器過濾，采用HPLC法測(cè)定效價(jià)(頭孢菌素C含量，下同)。

HPLC檢測(cè)條件：安捷倫SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm),流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相：0.01 mol·L-1乙酸鈉∶乙腈=98∶2(體積比)，pH值4.0。

1.3.4 紫外誘變

吸取5 mL菌懸液置于無菌玻璃平皿中，置于紫外燈下照射，間距15 cm；每隔一定時(shí)間(10 s、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s)吸取菌懸液，稀釋后涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，以未經(jīng)紫外燈照射的菌懸液作為對(duì)照，用黑紙包裹后置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算致死率，確定最佳紫外誘變時(shí)間。

在最佳紫外誘變時(shí)間下，再次進(jìn)行紫外誘變培養(yǎng)，挑取形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的單菌落，經(jīng)種子和發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)后測(cè)定效價(jià)。

1.3.5 紫外線和丙二酸復(fù)合誘變

將菌懸液紫外誘變一定時(shí)間(最佳誘變時(shí)間)，稀釋后涂布于含有不同濃度(0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%)丙二酸的PDA培養(yǎng)基平板上，然后置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算致死率，確定最佳丙二酸濃度。

在最佳紫外誘變時(shí)間、最佳丙二酸濃度下，再次進(jìn)行紫外線和丙二酸復(fù)合誘變培養(yǎng)，挑取形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的單菌落，經(jīng)種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定效價(jià)，篩選頭孢菌素C高產(chǎn)菌株。

1.3.6 高產(chǎn)菌株篩選及遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在確定的最佳復(fù)合誘變條件下，對(duì)菌懸液進(jìn)行多次復(fù)合誘變處理，進(jìn)一步篩選高產(chǎn)菌株。將最終選育出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，經(jīng)種子和發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)后測(cè)定效價(jià)，驗(yàn)證高產(chǎn)性能的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳復(fù)合誘變條件下，對(duì)篩選到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行50 L發(fā)酵罐小試。首先將搖瓶種子液接入15 L一級(jí)種子罐，再將一級(jí)種子液接入50 L二級(jí)種子罐，然后將二級(jí)種子液接入50 L發(fā)酵罐中，每12 h取樣測(cè)定效價(jià)。整個(gè)過程嚴(yán)格按照工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)控。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變結(jié)果

菌懸液經(jīng)過不同時(shí)間的紫外誘變，稀釋后涂布于培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)7 d后計(jì)算致死率，考察紫外誘變時(shí)間對(duì)致死率的影響，結(jié)果見表1。

表1 紫外誘變時(shí)間對(duì)致死率的影響

由表1可知，隨著紫外誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸升高；0～90 s內(nèi)致死率升高明顯，90 s后致死率升幅趨緩；紫外誘變90 s時(shí)的致死率為87.07%，紫外誘變120 s時(shí)的致死率達(dá)到96.55%。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，致死率在80%左右時(shí)正突變率較高，因此選擇紫外誘變時(shí)間為90 s。

2.2 紫外誘變效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

菌懸液經(jīng)過90 s紫外誘變后，通過培養(yǎng)篩選出形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌株共83株，經(jīng)種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，測(cè)定發(fā)酵液效價(jià)，結(jié)果見表2。

由表2可知，經(jīng)紫外誘變后的效價(jià)基本呈正態(tài)分布，效價(jià)在3 000～3 999 mg·L-1的菌株最多，有25株；其次是效價(jià)在4 000～4 999 mg·L-1，有18株；效價(jià)高于出發(fā)菌株B-1822-S-04(效價(jià)為4 520 mg·L-1)的有16株，占總數(shù)的19.28%，其中效價(jià)最高達(dá)到6 251 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了38.29%。

表2 紫外誘變后的頭孢菌素C效價(jià)

2.3 紫外線和丙二酸復(fù)合誘變結(jié)果

菌懸液經(jīng)過90 s紫外誘變，稀釋后涂布于含有不同濃度丙二酸的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)7 d后計(jì)算致死率，考察丙二酸濃度對(duì)致死率的影響，結(jié)果見表3。

表3 丙二酸濃度對(duì)致死率的影響

由表3可知，隨著丙二酸濃度的增加，致死率逐漸升高；當(dāng)丙二酸濃度增至1.2%時(shí)，致死率為100.00%。因此，1.0%是菌株對(duì)丙二酸的耐受臨界濃度。

2.4 復(fù)合誘變效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

菌懸液經(jīng)過90 s紫外誘變，稀釋后涂布于含有1.0%丙二酸的培養(yǎng)基平板上，通過培養(yǎng)篩選出形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌株共76株，經(jīng)種子和發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)后，測(cè)定發(fā)酵液效價(jià)，結(jié)果見表4。

由表4可知，經(jīng)過復(fù)合誘變后，效價(jià)在4 000～4 999 mg·L-1的菌株最多，有19株；效價(jià)高于出發(fā)菌株的有22株，占總數(shù)的28.95%，其中效價(jià)最高達(dá)到6 871 mg·L-1，較出發(fā)菌株B-1822-S-04提高了52.01%。

表4 復(fù)合誘變后的頭孢菌素C效價(jià)分析

2.5 高產(chǎn)菌株的篩選及其遺傳穩(wěn)定性

在紫外誘變時(shí)間為90 s、丙二酸濃度為1.0%的條件下，對(duì)菌株B-1822-S-04進(jìn)行多次紫外和丙二酸復(fù)合誘變，篩選到10株頭孢菌素C高產(chǎn)菌株，經(jīng)種子和發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)后測(cè)定效價(jià)，結(jié)果見表5。

表5 高產(chǎn)菌株的效價(jià)

由表5可知，10株頭孢菌素C高產(chǎn)菌株中效價(jià)較高的是菌株D-G-017、D-G-083、D-G-096和D-G-133，其效價(jià)分別為6 674 mg·L-1、6 554 mg·L-1、6 816 mg·L-1和6 789 mg·L-1，分別較出發(fā)菌株B-1822-S-04提高了47.65%、45.00%、50.80%和50.20%。

對(duì)4株高產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(表6)顯示，傳代5代后，4株高產(chǎn)菌株的效價(jià)雖有下降，但與出發(fā)菌株相差不大，說明這4株高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。將篩選的4株高產(chǎn)菌株分別保存，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

表6 4株高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

2.6 高產(chǎn)菌株的小試發(fā)酵結(jié)果

將篩選到的4株高產(chǎn)菌株分別在50 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)160 h，效價(jià)均呈上升趨勢(shì)，其中菌株D-G-096的效價(jià)最高達(dá)到了29 270 mg·L-1(圖1)，較搖瓶發(fā)酵的效價(jià)(6 816 mg·L-1)提高了約4倍，較出發(fā)菌株50 L發(fā)酵罐的效價(jià)(13 868 mg·L-1)提高了111.06%；菌株D-G-133、D-G-017、D-G-083的效價(jià)也分別提高了102.57%、94.70%、73.56%。

圖1 高產(chǎn)菌株小試發(fā)酵過程中的效價(jià)變化

2.7 討論

影響發(fā)酵水平的首要因素是菌種資源，性能優(yōu)良的菌種具有效價(jià)高、性能穩(wěn)定、不易退化變異、對(duì)原材料要求低等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用紫外線和丙二酸復(fù)合誘變的方法篩選頭孢菌素C高產(chǎn)菌株，雖然最終篩選出的菌株D-G-096搖瓶發(fā)酵的效價(jià)為6 816 mg·L-1，比出發(fā)菌株提高了50.80%，但是實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，過程較為復(fù)雜；而傳統(tǒng)誘變技術(shù)，例如孟國(guó)慶[12]、杜淑濤[13]通過原生質(zhì)體融合技術(shù)，Sun等[14]、陳國(guó)枝等[15]、胡又佳等[16]通過基因工程技術(shù)，李英英等[17]采用ARTP誘變技術(shù)，也能篩選出頭孢菌素C高產(chǎn)菌株，且簡(jiǎn)單快速、目的性更強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)將篩選的4株高產(chǎn)菌株進(jìn)行50 L發(fā)酵罐小試，其中菌株D-G-096的效價(jià)達(dá)到29 270 mg·L-1，是搖瓶發(fā)酵的4倍，較出發(fā)菌株的50 L發(fā)酵罐的效價(jià)提高了111.06%。牛永利[18]曾通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了50 L和5 t發(fā)酵罐效價(jià)沒有太大變化，可以將50 L發(fā)酵罐的工藝結(jié)論應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)中。但是由于菌種不同、培養(yǎng)基配方不同，后期還需要進(jìn)一步驗(yàn)證500 L、5 t發(fā)酵罐的中試發(fā)酵情況，將發(fā)酵工藝更好地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3 結(jié)論

以頭孢菌素C產(chǎn)生菌頂頭孢霉(Cephalosporiumacremonium) B-1822-S-04為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線和丙二酸復(fù)合誘變，篩選得到了4株頭孢菌素C高產(chǎn)菌株D-G-017、D-G-083、D-G-096和D-G-133，其中菌株D-G-096頭孢菌素C效價(jià)高達(dá)6 816 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了50.80%，且高產(chǎn)特性穩(wěn)定；50 L發(fā)酵罐小試結(jié)果顯示，菌株D-G-096的效價(jià)達(dá)到了29 270 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了111.06%，可作為優(yōu)良高產(chǎn)菌株保存使用。