澤蘭提取物調控NDRG2對低糖低氧所致的神經細胞損傷的影響

王靜，卓思思，喬楠

（河北北方學院附屬第一醫院神經內科，張家口 075000）

腦缺血已成為嚴重公共衛生威脅，中藥通過消除炎癥、抑制細胞凋亡、促進血管生成等作用在腦缺血的防治方面發揮越來越重要的作用[1-2]。研究中藥防治腦缺血的分子機制，對其靶向治療具有重要意義。

研究發現，澤蘭乙醇提取物對大鼠離體缺氧損傷心肌具有保護作用[3]，且發現澤蘭對大鼠局灶性腦組織缺血損傷及小鼠急性缺氧有不同程度的保護作用[4]，但澤蘭對神經細胞腦缺血損傷的影響及具體機制還不清楚。有報道發現，腦缺血再灌注損傷后，NDRG2 mRNA及蛋白表達量顯著增多[5]。電針預處理可通過抑制NDRG2表達來誘導腦缺血耐受[6]，七氟烷預處理可通過抑制腦組織星形膠質細胞NDRG2的表達和活性，減輕細胞凋亡、改善細胞功能，減輕腦缺血再灌注損傷[7]。本研究假設澤蘭提取物可能通過調控NDRG2發揮對神經細胞腦缺血保護作用。

本研究通過對腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞進行缺糖缺氧處理方式建立神經細胞腦缺血損傷細胞模型，以上調和下調NDRG2表達的方法來檢測澤蘭提取物影響模型細胞增殖、凋亡的作用機制，探尋澤蘭提取物對神經細胞腦缺血損傷的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞購自ATCC；澤蘭購自中藥材市場，經本院黃尚峰教授鑒定；RPMI-1640培養基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，胰蛋白酶Trypsin、噻唑藍（MTT）和二甲基亞礬（DMSO）、多聚甲醛購自Sigma-Aldrich公司；兔抗鼠 NDRG2抗體（貨號：sc-376202）、Cyclin D1抗體（貨號：sc-8396）、p21抗體（貨號：sc-6246）、Bcl-2 抗體（貨號：sc-166943）、Bax抗體（貨號：sc-7480）和 GAPDH 抗體（貨號：sc-47724）購自美國 Santa公司；si-NDRG2、pcDNA3.1-NDRG2、si-NC和pcDNA3.1購自蘇州吉瑪基因；流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；流式細胞儀購自美國BD公司，顯微鏡購自日本Olympus，全自動酶標儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組 將PC12細胞培養在含10%FBS的RPMI1640培養基中（含100 U/mL青霉素+1%鏈霉素），于飽和濕度、5%CO2、37℃培養箱中常規培養，胰蛋白酶消化傳代，傳至10～20代時進行實驗。

對照組：PC12細胞正常培養；模型組：根據文獻[8]的方法，將過夜培養貼壁的PC12細胞用無糖Earles平衡鹽溶液洗滌2次，換為無糖氧-糖剝奪（OGD）液，置于密閉OGD罐內通入95%N2-5%CO2氣體30 min，然后置培養箱中培養2 h，棄OGD液更換為RPMI1640培養基，培養24 h。檢測葡萄糖含量和O2含量，以證明符合缺氧缺糖的缺血模型。轉染組：模型組進行處理完成后培養24 h后進行轉染。模型組+藥物處理組：根據文獻[3]的方法制備澤蘭提取物，具體方法：稱取500 g澤蘭，切碎，置于95%乙醇中浸泡24 h，依次采用6倍與4倍藥物體積的乙醇回流提取，應用回旋式減壓濃縮機濃縮，冷凍干燥后得到粉末狀藥物，獲得澤蘭提取物4.75 g，將其置于DMSO（0.1%）溶液中配置母液，調整溶液濃度為10 g/L，用0.1、1、10 mg/mL的提取物對細胞進行處理。

1.2.2 細胞轉染 將PC12細胞用培養液稀釋為2×105個/mL接種于6孔板中，培養至細胞基本融合為一層時按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染。轉染分組：NDRG2抑制組（轉染si-NDRG2，以轉染si-NC組為對照）和NDRG2過表達組（轉染pcDNA3.1-NDRG2，以轉染pcDNA3.1為對照）。轉染48 h后收集細胞進行驗證。

1.2.3 MTT實驗測定細胞增殖抑制率 收集澤蘭提取物處理或轉染48h的PC12細胞，以2×103個/孔接種于96孔板，在培養至24、48和96 h的時候進行 MTT 實驗，加入 20 μL（5 g/L）MTT，培養 4 h，棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩10 min，酶標儀測定OD490nm處的吸光度（A）值。

1.2.4 流式細胞術測定細胞凋亡率 收集各組PC12細胞，以每孔2×104個細胞接種于6孔板中，培養至融合度達到約80%，棄去培養液，洗滌消化，收集細胞，按照Annexin V/PI試劑盒說明書進行操作，先加200 μL binding buffer重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC 和 5μL 碘化丙啶（PI），室溫避光孵育20 min，上流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達 收集各組PC12細胞，超聲破碎并離心收集蛋白，測定總蛋白濃度。取蛋白樣本進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗NDRG2（1∶1 000）、Cyclin D1 抗體（1∶3 000）、p21 抗體（1∶2 000）、Bcl-2 抗體（1∶2 000）、Bax 抗體（1∶2 000）和 GAPDH 開頭（1∶4 000），4℃孵育過夜，TBST 洗膜2次，加入稀釋的二抗室溫孵育1 h，顯影拍照，以GAPDH為內參照，分析蛋白表達水平。

1.3 統計學處理 數據分析采用SPSS 23.0統計軟件，結果以均數±標準差（±s）表示。多個實驗組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 澤蘭提取物對腦缺血損傷模型增殖的影響 與對照組相比，模型組PC12細胞OD值顯著降低，CyclinD1表達降低，p21表達升高，差異均具有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，模型組+澤蘭提取物1 mg/mL和模型組+澤蘭提取物10 mg/mL組PC12細胞OD值升高，CyclinD1表達升高，p21表達降低，差異均具有統計學意義（P<0.05），澤蘭提取物可促進腦缺血損傷模型PC12細胞增殖，見圖1。

圖1 澤蘭提取物對腦缺血損傷模型增殖的影響Fig.1 Effects of Lycopus lucidus Turcz extract on proliferation of cerebral ischemicinjury model PC12 cells

2.2 澤蘭提取物對腦缺血損傷模型凋亡的影響 與對照組相比，模型組PC12細胞凋亡率均升高，Bax表達升高，Bcl-2表達下降，差異均具有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，模型組+澤蘭提取物1 mg/mL和模型組+澤蘭提取物10 mg/mL組PC12細胞凋亡率均降低，Bax表達降低，Bcl-2表達升高，差異均具有統計學意義（P<0.05），見圖2。澤蘭提取物可抑制腦缺血損傷模型PC12細胞凋亡。

圖2 澤蘭提取物對腦缺血損傷模型凋亡的影響Fig.2 Effects of Lycopus lucidus Turcz extract on apoptosis of cerebral ischemic injury model PC12 cells

2.3 澤蘭提取物對腦缺血損傷模型中NDRG2表達的影響 與對照組相比，模型組PC12細胞中NDRG2表達升高（P<0.05）；與模型組比較，模型組+澤蘭提取物1 mg/mL和模型組+澤蘭提取物10mg/mL組PC12細胞中NDRG2表達降低（P<0.05），見圖3。澤蘭提取物可抑制腦缺血損傷模型PC12細胞中NDRG2表達。

圖3 澤蘭提取物對腦缺血損傷模型中NDRG2表達的影響Fig.3 Effects of Lycopus lucidus Turcz extract on expression of NDRG2 in cerebral ischemic injury model PC12 cells

根據以上結果，澤蘭提取物10 mg/mL組效果最佳，選擇10 mg/mL澤蘭提取物進行后續實驗。

2.4 抑制NDRG2對腦缺血損傷模型增殖、凋亡的影響 與模型組+si-NC組相比，模型組+si-NDRG2組P12細胞OD值升高，凋亡率下降，NDRG2、p21和Bax表達降低，Cyclin D1和Bcl-2表達升高，差異均具有統計學意義（P<0.05），見圖4。說明抑制NDRG2表達可促進模型組PC12細胞增殖并抑制細胞凋亡。

圖4 抑制NDRG2對腦缺血損傷模型增殖、凋亡的影響Fig.4 Effects of NDRG2 inhibition on proliferation and apoptosis of cerebral ischemic injury model PC12 cells

2.5 過表達NDRG2能逆轉澤蘭提取物對腦缺血損傷模型增殖的促進作用 與模型組相比，模型組+澤蘭10mg/mL組PC12細胞OD值升高，NDRG2和p21表達降低，Cyclin D1表達增多，差異均具有統計學意義（P<0.05）；與模型組+澤蘭 10 mg/mL+pcDNA3.1組相比，模型組+澤蘭10 mg/mL+pcDNA3.1-NDRG2組PC12細胞OD值降低，NDRG2和p21表達增多，CyclinD1表達降低，差異均具有統計學意義（P<0.05），見圖5。過表達NDRG2可逆轉澤蘭提取物對模型組PC12細胞增殖促進作用。

圖5 過表達NDRG2能逆轉澤蘭提取物對腦缺血損傷模型增殖的促進作用Fig.5 Over-expression of NDRG2 reversed the effect of Lycopus lucidus Turcz extract on proliferation of cerebral ischemic injury model PC12 cells

2.6 過表達NDRG2能逆轉澤蘭提取物對腦缺血損傷模型凋亡的抑制作用 與模型組相比，模型組+澤蘭10 mg/mL組PC12細胞OD值升高，NDRG2和p21表達降低，Cyclin D1表達增多，差異均具有統計學意義（P<0.05）；與模型組+澤蘭10mg/mL+pcDNA3.1組相比，模型組+澤蘭10 mg/mL+pcDNA3.1-NDRG2組PC12細胞OD值降低，NDRG2和p21表達增多，Cyclin D1表達降低，差異均具有統計學意義（P<0.05），見圖5。過表達NDRG2可逆轉澤蘭提取物對模型組PC12細胞凋亡抑制作用。

3 討論

澤蘭提取物具有抗癌、抗氧化和抗菌活性[9]。澤蘭水提取物可能通過調控PI3K/Akt信號通路，調節HIF-1a及其下游蛋白表達，保護心肌細胞H9C2免受H/R誘導的細胞損傷[10]。澤蘭對糖尿病大鼠視網膜病變具有保護作用，可減輕氧化應激、炎癥和血管生成因子的水平[11]。本研究通過對PC12細胞進行缺糖缺氧處理方式建立神經細胞腦缺血損傷細胞模型，然后用0.1、1、10 mg/mL的澤蘭提取物對模型組細胞進行處理，發現1 mg/mL和10 mg/mL澤蘭提取物均可使模型組PC12細胞OD值升高，CyclinD1和Bcl-2表達升高，p21和Bax表達降低，促細胞增殖并抑制細胞凋亡，驗證了澤蘭提取物對腦缺血的保護作用。

圖6 過表達NDRG2能逆轉澤蘭提取物對腦缺血損傷模型凋亡的抑制作用Fig.6 Over-expression of NDRG2 reversed the effect of Lycopus lucidus Turcz extract on apoptosis of cerebral ischemic injury model PC12 cells

NDRG2是一種與腫瘤抑制和細胞應激相關的基因，參與癌癥能量代謝和上皮-間質轉化（EMT），與腫瘤的發生、進展和轉移有關[12-13]。NDRG2在短暫的局灶性腦缺血耐受反應性星形膠質細胞中顯著上調，C6來源的星形膠質細胞在OGD暴露后p53相關的凋亡調節因子，沉默NDRG2表達具有促增殖作用，可降低OGD暴露后Bax/Bcl-2比值[14]。2-花生四烯基甘油（2-AG）通過阻斷NDRG2信號和STAT3磷酸化來保護缺氧-葡萄糖環境中的原代星形膠質細胞[15]。在實驗性腦缺血再灌注（I/R）大鼠模型中，抑制miR-301a可靶向NDRG2改善細胞凋亡和炎癥反應，對大鼠腦I/R損傷有神經保護作用[16]。本研究結果發現，模型組PC12細胞中NDRG2蛋白表達量均顯著上調，與上述結論[14]一致；1 mg/mL和10 mg/mL澤蘭提取物均可抑制模型組細胞中NDRG2表達，抑制NDRG2表達可促進模型組PC12細胞增殖并抑制細胞凋亡；過表達NDRG2可逆轉澤蘭提取物對模型組PC12細胞增殖和凋亡的作用，證實了澤蘭提取物通過調控NDRG2對神經細胞腦缺血起保護作用。

綜上，本研究闡述了在腦缺血細胞模型中，澤蘭提取物可通過抑制NDRG2的表達，促進細胞增殖并抑制細胞凋亡。說明澤蘭提取物對神經細胞腦缺血具有潛在的治療作用，NDRG2可能是腦缺血的潛在分子靶點。