miR-99b-5p 靶向FGFR3 對紫杉醇誘導慢性神經病理性疼痛形成的影響*

韓 聰 徐 力 曾文玉 辜文艷 劉 慶△

（西南醫科大學附屬中醫醫院1 疼痛科；2 手術室，瀘州646000）

紫杉醇 (paclitaxel, PTX) 是屬于紫杉烷類的一種天然生物堿，目前作為臨床一線廣譜使用的抗腫瘤藥物，抗腫瘤療效較好，已被大量應用于癌癥病人救治[1]。紫杉醇能夠控制微管蛋白發生聚合，保持微管蛋白的穩定性，抑制細胞有絲分裂進而抑制惡性腫瘤細胞的增殖從而達到治療效果[2]。但是，目前仍存在著許多臨床問題，在治療過程中表現的藥物神經毒性問題仍未得到解決，病人會在治療后數月或者數年持續存在神經病理性疼痛通常是由藥物造成的感覺系統損傷引起的[3]。這種劇烈的疼痛給病人帶來身體和精神上巨大的痛苦，已經成為紫杉醇在治療腫瘤方面存在的不容忽視的健康問題[4]。

MicroRNA (miRNA) 通常是具由19～25 個核苷酸組成的高度保守非編碼小分子單鏈RNA[5]。MicroRNA 在外周神經具有調節神經元的興奮性參與和維持慢性神經病理性疼痛的作用，如過表達的miR-7a對大鼠神經病理性疼痛具有保護作用[6]。背根神經節是感覺傳導的初級神經元，在疼痛的外周發病機制中有著不可忽視的作用[7]。miR-99b-5p 能夠參與腫瘤和關節炎發病過程，同時miR-99b-5p 也能調控Akt/mTOR/STAT3 信號通路修復脊髓損傷[8]。agomir-99b-5p 是經過特殊化學修飾的miR-99b-5p 激動劑，可直接注射于動物體內。通過生物信息學分析發現成纖維細胞生長因子受體3 (fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3)的3'-非編碼區 (3'-untranslated region,3'-UTR)是miR-99b-5p 潛在靶點。FGFR3 是成纖維細胞生長因子受體家族成員(FGFR1-4)之一，作為一種酪氨酸激酶受體，包含了配體結合結構域、跨膜結構域和酪氨酸激酶結構域[9]。FGFR3在與配體（如FGF2/9/18）結合后，其酪氨酸激酶結構區發生磷酸化，進而激活下游RAS-MAPK、PI3K-AKT、MEK/ERK、PLCγ 和STAT 等胞內信號通路[10,11]。這些信號通路與炎癥的發生發展密切相關，同時，促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 通過增強興奮性電流、抑制抑制性電流、促進NMDA 釋放興奮遞質谷氨酸等影響神經病理性疼痛[12]。因此，通過本研究可獲得miR-99b-5p 過表達可能通過負向調控FGFR3 表達，從而抑制炎性反應，進而改善神經痛行為的實驗數據，形成miR-99b-5p作為化療藥物毒副作用治療靶點的理論體系。

方 法

1.實驗材料

紫杉醇針劑購買于海南中化聯合藥業；雙報告基因檢測試劑盒購買于上海翊圣生物科技公司。Trizol 和RT-qPCR 試劑盒（反轉加定量）購買于日本TAKARA 公司；FGFR3 抗體購買于ABCAM(ab231442)公司。h-FGFR3 雙熒光載體構建于上海生工生物科技有限公司。

2. 方法

（1）實驗動物飼養及模型建立：本實驗動物進行的研究行為均嚴格遵守相關動物保護及使用規定，并已通過西南醫科大學實驗動物福利倫理委員會批準（SWMU20210385）。雄性SPF 級大鼠，8周齡，體重220±30 g，購買于達碩動物實驗中心，生產許可證編號：SCXK（川）2020-030。選擇10只SPF 級大鼠分為空白組和模型組，模型組采用腹腔隔日注射紫杉醇（2 mg/kg，共4 次）的方法制備紫杉醇誘導慢性神經病理性疼痛小鼠模型，空白組注射等體積無紫杉醇藥物溶劑，進行預實驗，檢測大鼠miR-99b-5p 和FGFR3 的變化以及行為學的改變。預實驗結束后再選擇32 只SPF 級大鼠作為研究對象，適應性喂養1 周，大鼠按照簡單隨機化的方法隨機分為空白組 (blank)、紫杉醇模型組(model)、agomiR-99b-5p 治 療 組 和agomiR-NC 對照組，每組8 只。

按照預實驗方法進行模型建立，在藥物注射后相同時間點每日尾靜脈注射agomiR-99b-5p 和agomiR-NC，在實驗最后一次注射agomiR-99b-5p和agomiR-NC 后，當日1 h 和3 h 分別檢測各組大鼠后足機械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 和熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)。完成行為學試驗后處死大鼠，收集各組大鼠背根神經節，用RT-qPCR 法檢測背根神經節中miR-99b-5p、TNF-α、IL-6 及IL-1β 含量，Western Blot 檢測FGFR3 表達。

（2）行為學測定：使用vonFrey 纖維絲推算大鼠50%縮足閾值：透明有機玻璃箱 (22 cm×12 cm×22 cm)安置在40 cm 高的金屬篩網上，大鼠置于箱內安靜適應15 min，使用vonFrey 纖維絲垂直刺激大鼠右側后肢足底中部，持續時間6～8 s，大鼠表現為抬足或舔足被判定為陽性反應，相反則為陰性。最大刺激克數為15 g，大于15 g 時也記為15 g，每次刺激間隔30 s。首先從2 g 纖維絲刺激開始，當該力度刺激不能造成陽性反應，則使用相鄰大一級力度的刺激，如出現陽性反應則使用相鄰小一級力度的刺激，連續操作，直到第1 次陽性反應出現為止，再連續測試4 次。使用熱輻射法測定大鼠TWL，將有機玻璃箱置于3 mm 厚的玻璃板上，對大鼠右側后肢足底使用輻射熱測痛儀照射，測試前大鼠安靜適應15 min。以5 mm 光斑照射大鼠右側第一足趾下著力點開始計時，直至大鼠出現抬腿回避時為一次有效數據。為防止大鼠足底灼傷，自動切斷時間為20 s。熱刺激強度在實驗過程中維持一致。每只大鼠測定6 次，每5 min 測試1 次，去掉最大值和最小值，取4 次測量的平均值作為TWL。

（3）RT-qPCR 實驗：用Trizol 試劑盒提取大鼠背根神經節mRNA，利用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA。嚴格按照試劑盒要求進行實時熒光定量操作，GAPDH 作為內參。2-ΔΔCt法計算目的基因的表達量。miR-99b-5p 的引物由miRBASE 數據庫獲得成熟序列，采用加尾法設計獲得，其他引物由文獻獲得并在NCBI Primerblast 進行驗證后由上海生工生物合成科技有限公司采用PAGE 技術合成。引物miR-99b-5p: 5'-CACCCGTAGAACCGACCTTGCG-3', 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'; U6: 5'-CTCGCTTCGCTTCGGCAGCACA-3', 5'-AACGCTTGAGGAATTTGCGT-3'; IL-1β: 5'-CGACAAGAGCTTCAGGAAGGCAGTG-3', 5'-TGGGTCAGACAGCACAGG CATTT-3'; IL-6: 5'-CCGCAAGAGACTTCCAGCCAGTTG-3', 5'-CGGAAC TCCAGAAGACCAGAGCAGA-3'; TNF-α:5'-CCACACCGTCAGCCGATTTGCCATT-3', 5'-TGAACACGCCAGTCGACTCACAGA-3';GAPDH: 5'-TCGGCATTGTGG AGGGGCT C-3', 5'-TCCCG TTCAGCTC GGGGATG-3'。

（4）Western Blot 實驗：將大鼠背根神經節進行組織勻漿裂解，用BCA 蛋白濃度試劑盒測量蛋白濃度，SDS-PAGE 進行分離，用5%的脫脂奶粉封閉后，使用等量蛋白質上樣，選擇10%的SDSPAGE 進行分離，轉模，結合一抗 (FGFR3)。4℃孵育過夜后TBST 清洗，用對應的二抗室溫孵育，ECL暗室顯色，使用Bio-Rad 全功能成像系統采集圖像，以β-actin 為內參，計算各蛋白的相對表達量。

（5）雙熒光素酶報告基因系統：設計構建FGFR3 的3'UTR 突變和未突變螢光素酶報告基因質粒，體外培養人胚腎HEK-293T 細胞，用LipofectamineTM3000 將miR-99b-5p mimics 或NC-mimic 轉 染 至 對數期的HEK-293T 細胞，繼續培養48 h 后收集細胞，根據試劑盒操作說明，取50 μl 細胞裂解液于半量板，多功能酶標儀上機檢測各組細胞熒光強度。

3. 統計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，數據用均數±標準差(±SD)表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)，P< 0.05 為差異具有統計學意義。

結 果

1. 前期預實驗及可行性驗證

對大鼠按照空白組和模型組進行基礎閾值測定，去除耐受性差異較大的個體，排除不可控干擾因素（見圖1A, B）。前期預實驗檢測miR-99b-5p在背根神經節的表達，確定與空白組相比，模型組miR-99b-5p 的表達顯著降低（見圖1C），證明實驗的可行性。Western Blot 檢測發現FGFR3 在模型組背根神經節的表達相較于空白組顯著升高（見圖1D）。對完成注射紫杉醇誘導的大鼠模型，進行MWT 和TWL 檢測，與空白對照組比，模型組MWT 和TWL 均顯著低于空白組，提示模型建立成功（見圖1E, F）。

圖1 FGFR3 與miR-99b-5p 在紫杉醇誘導疼痛模型的表達(A) 空白組與模型組紫杉醇誘導前MWT；(B) 空白組與模型組紫杉醇誘導前TWL；(C) 空白組與模型組完成紫杉醇誘導后miR-99b-5p 表達；(D) 空白組與模型組完成紫杉醇誘導后FGFR3 蛋白顯影及結果統計；(E) 紫杉醇誘導后大鼠MWT；(F) 紫杉醇誘導后大鼠TWL**P < 0.001，***P < 0.0001，與空白組相比Fig. 1 Expression of FGFR3 and miR-99b-5p in Paclitaxel-induced rats Model(A) MWT before paclitaxel induction in rats; (B) TWL before paclitaxel induction in rats; (C) Expression of miR-99b-5p after completion of paclitaxel induction in rats; (D) The protein level of FGFR3 after completion of paclitaxel induction in rats; (E) MWT after paclitaxel induction; (F) TWL after paclitaxel induction.**P < 0.001, ***P < 0.0001, compared with the group blank.

2. agomiR-99b-5p 對大鼠痛覺行為及FGFR3 蛋白的影響

在注射agomiR-99b-5p 前，各組大鼠進行MWT和TWL 檢測基礎痛閾值，剔除差異較大個體后，所有實驗大鼠MWT 和TWL 在各組之間的基礎閾值無顯著性差異（見圖2 A, B）。大鼠最后一次注射agomiR-99b-5p 后1 h，后足MWT 實驗結果模型組顯著低于空白組， 顯示空白組為(14.78±0.30)、模 型 組 為(8.85±0.55)、agomiR-99b-5p 治 療 組 顯著 高 于 模 型 組 為(14.56±0.38)、agomiR-NC 組 為(9.06±0.34)，見圖2C。在藥物注射后3 h 測量大鼠TWL，結果顯示發現大鼠空白組TWL 反應時間為(14.15±0.65)、模型組TWL (8.84±0.50)，模型組TWL 和空白組相比反應明顯縮短，提示模型組出現了熱痛敏現象，模型組TWL 反應時間明顯縮短，表明建模成功；與模型組比，agomiR-99b-5p 治療組反應時間為(13.76±0.63)，與空白組幾乎一致，而與agomiR-NC 組(9.14±0.43)比較，反應時間延長（見圖2D）。完成行為學實驗后處死大鼠，收集大鼠背根神經節進行RT-qPCR 檢測agomiR-99b-5p注射后大鼠miR-99b-5p 的變化，治療組miR-99b-5p含量明顯高于模型組（見圖2E）。將收集的大鼠背根神經節進行Western Blot 檢測，結果顯示在agomiR-99b-5p 治療組FGFR3 的含量明顯低于模型組（見圖2F）。

圖2 agomiR-99b-5p 對大鼠痛覺行為及FGFR3 蛋白的影響(A) 紫杉醇誘導前MWT 基礎閾值；(B) 紫杉醇誘導前TWL 基礎閾值； (C) 給予miR-99b-5p 后MWT；(D)治療后TWL；(E) 治療后miR-99b-5p；(F) 治療后FGFR3 蛋白顯影及結果統計*P < 0.05，**P < 0.001Fig. 2 The effect of agomiR-99b-5p on pain behavior and FGFR3 protein expression in rats(A) Basal threshold of MWT in rats before paclitaxel induction; (B) Basal threshold of TWL in rats before paclitaxel induction; (C) MWT in rats after treatment of miR-99b-5p; (D) TWL in rats after treatment; (E) miR-99b-5p level in rats after treatment; (F) The protein level of FGFR3 in rats after treatment. *P < 0.05, **P < 0.001.

3.大鼠背根神經節中炎癥因子表達

取大鼠背根神經節，檢測agomiR-99b-5p 對大鼠背根神經節炎癥因子的調控作用。模型組和agomiR-NC 組TNF-α 和IL-6 無明顯統計學差異，而與空白組比，模型組TNF-α 和IL-6 水平較高。同時，與 模型組組比，agomiR-99b-5p 給藥組TNF-α 和IL-6 水平顯著降低，而與空白組則無明顯差異（見圖3A, B)。大鼠背根神經節中IL-1β 無統計學差異，但與模型組相比，agomiR-99b-5p 給藥組較模型組具有下降的趨勢且與空白組一致（見圖3C)。

圖3 大鼠背根神經節中炎癥因子表達(A) 治療后TNF-α mRNA 水平；(B) 治療后IL-6 mRNA 水平；(C) 治療后IL-1β mRNA 水平*P < 0.05Fig. 3 The expression of inflammatory factors in rat dorsal root ganglion(A) The mRNA level of TNF-α; (B) The mRNA level of IL-6; (C) The mRNA level of IL-1β. *P < 0.05

4. 雙熒光素酶報告基因驗證miR-99b-5p 對FGFR3 的靶向抑制作用

通 過Targetscan 發 現FGFR3 是miR-99b-5p 的潛在靶基因，從數據庫中獲得了miR-99b-5p 與FGFR3 的結合位點（見圖4A）。h-FGFR3 選擇雙熒光為載體構建質粒，作為miR-99b-5p 與FGFR3 的靶向關系理論驗證（見圖4B）。報告基因結果顯示，與NC mimics 相比，hsa-miR-99b-5p 能夠顯著抑制h-FGFR3-3UTR-wt 質粒的轉錄活性，而NC mimics和hsa-miR-99b-5p 對h-FGFR3-3UTR-mu 質粒的活性則無影響（見圖4C）。為進一步驗證miR-99b-5p 對FGFR3 的靶向抑制作用，Western Blot 檢測實驗細胞HEK-293T 的FGFR3 的 變 化，與NC mimics 給藥組相比，miR-99b-5p 的作用下FGFR3 蛋白表達水平顯著降低（見圖4D）。

圖4 miR-99b-5p 對FGFR3 的靶向抑制作用(A) Targetscan 獲得miR-99b-5p 與FGFR3 的結合位點圖；(B) h-FGFR3 雙熒光質粒結構示意圖；(C) 雙報告基因miR-99b-5p 與FGFR3 靶向關系驗證結果統計圖；(D) HEK-293T 細胞中FGFR3 的表達*P < 0.05，**P < 0.001.Fig. 4 The targeted inhibitory effect of miR-99b-5p on FGFR3(A) Binding site map of miR-99b-5p and FGFR3 obtained by Targetscan; (B) Schematic diagram of h-FGFR3 dual fluorescent plasmid; (C) Relationship between miR-99b-5p and FGFR3; (D) Expression of FGFR3 in HEK-293T cells.*P < 0.05, **P < 0.001.

討 論

神經病理性疼痛的發生機制較復雜，為一種常見的慢性疾病，為病人的生活帶來了沉重的負擔，其具體發病機制并不明確，臨床表現為痛覺過敏及觸覺異常性疼痛，目前尚無非常有效的治療藥物[13,14]。嚴進紅等[15]證明，紫杉醇處理能引起大鼠脊髓中炎癥因子TNF-α 及IL-1β 的水平升高。miR-99b-5p 在脊髓損傷小鼠脊髓中高表達，沉默miR-99b-5p 能抑制脊髓損傷導致的神經元數量和神經突觸數量減少[16]。FGFR3 在多種疾病的炎癥和免疫反應中發揮重要作用，能下調抑制機體的炎癥損傷[17]。本研究顯示agomiR-99b-5p 能夠改善大鼠神經性疼痛的形成，雙熒光素酶實驗證明miR-99b-5p 能夠靶向FGFR3。實驗結果表明agomiR-99b-5p 治療組炎癥因子的表達水平也顯著低于紫杉醇誘導模型組。miR-99b-5p 靶向抑制FGFR3，從而抑制下游信號通路的傳導，進一步抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 的產生。

細胞因子與神經病理性疼痛的發生和維持密切相關，促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6，它們調節神經病理性疼痛機制復雜，可能直接參與了神經病理性疼痛的產生。芍藥甘草湯水提物對坐骨神經痛模型大鼠有明顯鎮痛作用，其作用機制與減少脊髓后角IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平有關[18]。雷公藤甲素可緩解脊神經結扎大鼠疼痛，并具有預防性鎮痛作用，其機制表明與阻礙膠質細胞的激活（星形膠質細胞和小膠質細胞），抑制MAPKs 磷酸化，抑制炎癥細胞因如IL-6、IL-1β 及TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein, MCP-1) 的表達有關[19,20]。miRNA 也是體內具有調節炎癥因子功能的一類的分子，miRNA-136-5p 能夠調節炎癥因子，對急性脊髓損傷模型大鼠具有一定保護作用[21]。miR-99b-5p 能夠靶向FGFR3，進而影響腫瘤、炎癥反應、免疫反應的發生，FGFGR3 能直接調節巨噬細胞功能，進而影響炎癥反應[17]。同時，TNF-α 是機體炎癥的重要啟動因子，能夠促使IL-1β 和IL-6等炎癥因子的釋放，也能誘使EAA 和C-反應蛋白出現神經毒性作用[22]。因此，大鼠慢性神經病理性疼痛的消失可能與炎癥因子的減弱有一定的關系。

綜合對注射紫杉醇后大鼠的機械閾值改變、背根神經節中炎癥因子變化分析，本研究認為，隔日腹腔注射2 mg/kg 紫杉醇可以成功建立大鼠神經病理性疼痛模型，表現為外周感覺神經的機械超敏，且出現顯著的miR-99b-5p 含量減少和FGFR3 表達增加。agomiR-99b-5p 注射給藥能夠誘導miR-99b-5p 的表達水平增加，對紫杉醇誘導疼痛模型具有顯著的治療作用。因此，基于miR-99b-5p 探索化療后神經疼痛的機制，有助于為臨床治療提供一定理論依據。

綜上所述，紫杉醇誘導的慢性神經病理性疼痛大鼠模型表現為痛反應增強，而agomiR-99b-5p 治療組大鼠的MWT 和TWL 值明顯減小，說明miR-99b-5p 對紫杉醇誘導的慢性神經病理性疼痛具有顯著的治療效果。本研究首次探究miR-99b-5p 在紫杉醇誘發神經病理性疼痛模型大鼠背根神經節中的表達情況，并探究其通過FGFR3 對紫杉醇誘導的SD大鼠神經病理性疼痛行為學和炎癥反應的影響，為micorRNA 在疾病的臨床治療提供了前瞻性的理論依據。然而，miR-99b-5p 在靶向抑制FGFR3 后下游的相關信號通路并未做深入研究。因此，接下來的研究重點為miR-99b-5p 影響神經病理性疼痛的涉及到的相關信號通路傳導機制。