超聲波輔助黃芩總黃酮提取及抗氧化性能研究

辛瑩娟，李 禎

(咸陽職業技術學院，陜西 咸陽 712000)

黃芩是中醫治療皮膚病的常用藥材，同時黃芩具有清熱、解毒、涼血、安胎等功效而被廣泛應用[1～3]。目前，研究人員已從中藥黃芩中發現了包括黃酮類、皂苷類等2 000余種有效物質，但其中應用最廣泛的為黃酮類化合物，具有抗氧化、抗變態反應、抑菌、抗病毒、鎮靜等功能，可治療哮喘等呼吸道感染、過敏性疾病、婦科疾病及皮膚科疾病(如：痤瘡、酒糟鼻、銀屑病、日曬性皮炎、黑斑等)[3～11]。

對比浸提、煎煮和回流等傳統中藥黃酮類化合物提取方法，超聲能在低頻作用下使草本藥物細胞瞬間空化、破裂，促使藥物有效成分與提取溶劑充分接觸并增大其在溶劑中的溶解度，獲得高提取率[12]。筆者研究擬通過超聲輔助提取技術以降低溶劑消耗，明確相關提取技術的最佳工藝參數。并且，進一步考察黃芩總黃酮的DPPH抗氧化性能，為黃芩黃酮產品開發奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

1.1.1 實驗試劑 黃芩(陜西省咸陽市藥材市場)，無水乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、氫氧化鈉(AR，重慶茂業化學試劑有限公司)，蘆丁標準品(HPLC 98%，國家標準物質中心)，1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH，AR，Sigma-Aldrich公司)。

1.1.2 實驗儀器 MS180磁力攪拌器，L9雙光束紫外可見分光光度計，XSD-300超聲波清洗機，ZFY-2L旋轉蒸發儀，PHG9246電熱鼓風干燥箱，HX-200粉碎機，BP211D電子天平。

1.2 實驗步驟及表征

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制 于容量瓶中分別加入不同體積濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁標準品、5% NaNO2、10% Al(NO3)3、1.0 mol·L-1NaOH溶液，乙醇定容，搖勻。根據吸光度與濃度的線性關系得圖1標準曲線，方程為：A = 0.01666+9.40571C，R = 0.99998。

圖1 蘆丁標準曲線

1.2.3 黃芩總黃酮提取工藝 主要有:

(1)乙醇濃度對黃酮收率的影響。100 mL三角瓶中稱1 g黃芩細粉，按1∶20料液比分別加入(40%、50%、60%、70%、80%和90%)的乙醇液，40 ℃、54 kHZ、350 W超聲30 min，再于60 ℃回流1.0 h，抽濾后為濾液a，再對殘渣重復提取兩次后得濾液b和c，合并濾液，測定吸光度。

(2)料液比對黃酮收率的影響。同上述操作，以料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入60%乙醇液，40 ℃、54 kHZ、350 W超聲30 min，再于60 ℃回流1.0 h，抽濾后為濾液a，再對殘渣重復提取兩次后得濾液b和c，合并濾液，測定吸光度。

(3)提取溫度對黃酮收率的影響。同上述操作，以1∶40料液比加入60%的乙醇液，40 ℃、54 kHZ、350 W超聲30 min，分別于40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃回流1.0 h，抽濾后為濾液a，重復提取兩次后得濾液b和c，合并濾液，測定吸光度。

(4)提取時間對黃酮收率的影響。同上述操作，按1∶40加入60%乙醇液，40 ℃、54 kHZ、350 W超聲30 min，70 ℃分別回流0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，抽濾后為濾液a，重復提取兩次后得濾液b和c，合并濾液，測定吸光度。

(5)超聲時間對黃酮收率的影響。同上述操作，按1∶40加入60%乙醇液，40 ℃、54 kHZ、350 W超聲10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，再于70 ℃回流1.5 h，抽濾后為濾液a，重復提取兩次后得濾液b和c，合并濾液，測定吸光度。

1.2.4 抗氧化研究 DPPH法是基于DPPH自由基的孤獨電子與抗氧化劑配對使517 nm處DPPH的光吸收減弱或消失，線性對比獲得抗氧化劑的自由基清除率。因此，測定系列不同濃度的黃芩總黃酮試樣的自由基清除率，獲得關系圖譜。DPPH清除率按下式計算：

式中，A0：DPPH和無水乙醇；A1：DPPH和黃芩總黃酮溶液；A2：黃芩總黃酮溶液和無水乙醇。

2 實驗結果與分析

2.1 乙醇濃度對黃酮收率的影響

黃芩黃酮提取率隨乙醇濃度變化趨勢如圖2所示，60%乙醇濃度為極值點。當小于60%乙醇濃度時，黃酮有效溶出率隨乙醇含量提高而逐步增加，大于60%乙醇濃度時，由于乙醇含量越高，溶質黃酮類物質和干擾成分醇溶性雜質和脂溶性成分之間競爭性增強，黃酮提取率降低。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

2.2 料液比對黃酮收率的影響

料液比偏低時，雖然黃芩細粉可與溶劑充分接觸，但黃芩含量過低，有效成分含量過低。當料液比偏高時，增大了黃芩比率，料液有效接觸的同時提高了黃酮、可溶性蛋白、醇溶性和脂類物質等的溶出量，反而會導致黃酮組分分離損失增大，所以從圖3可知，1∶40為最佳料液比。

2.3 提取溫度對黃酮收率的影響

黃芩總黃酮提取率隨提取溫度的變化規律如圖4所示，提取溫度為70 ℃對應7.94%的最大提取率。逐步升高提取溫度可提高黃酮等藥效物質分子的運動速率，黃酮類物質擴散速度加快，能夠獲得高的黃酮提取率。但溫度過高，除了黃酮類化合物擴散加快，醇溶性雜質、多糖和脂溶性雜質擴散速度也隨之加快，兩者相互影響反而降低黃酮類化合物提取率。同時高溫提取過程中還伴隨著黃酮類化合物的氧化反應，故而提取率先增大后減小。

圖4 提取溫度對黃酮提取率的影響

2.4 提取時間對黃酮收率的影響

干燥的黃芩細粉被乙醇溶液充分浸潤并溶解出黃酮類有效成分需一定的時間，因此，逐漸提高黃芩細粉與乙醇接觸時間，將獲得越來越高的黃酮提取量，當提取1.5 h時，提取率最大(從圖5可知)。但是，高溫下黃芩細粉與溶劑乙醇接觸時間過長，會導致黃酮在高溫下逐步發生氧化、分解等反應而發生變質，且脂溶性雜質、醇溶性雜質等的溶解析出會影響黃酮溶出率，反而使提取率下降。

圖5 提取時間對黃酮提取率的影響

2.5 超聲時間對黃酮收率的影響

超聲是利用高頻聲波所產生的機械、空化和熱效應等綜合效應，擊破中藥材細胞壁，提高目標物黃酮類化合物的穿透力和擴散能力。因此，從圖6可知，超聲時間越長，高頻聲波作用于黃芩細粉的綜合能量越高，提取率越大。但當增長超聲時間超過40 min對應的8.53%最高黃酮提取率時，提取率變化極小。

圖6 超聲時間對黃酮提取率的影響

2.6 黃芩總黃酮抗氧化性能的影響

黃酮類化合物可有效清除人體中性質活潑的自由基，降低由于自由基存在所導致的蛋白質變性、細胞功能破壞等問題，并提高人體細胞抗氧化的能力，改善自由基強氧化性所造成的心血管、衰老等疾病。從圖7可知，黃酮濃度越大自由基清除率越大，100 mg·mL-1時最大為65.33%。

圖7 黃酮的自由基清除率

3 結論

黃芩在中藥化妝品中廣泛應用，其中作為黃芩主要藥效物質的黃酮類化合物研究和應用最多。采用超聲輔助技術和傳統的乙醇回流技術相結合提取黃芩中的總黃酮，考察了兩種提取技術相結合應用中的多個提取工藝參數，對比分析獲得60%乙醇濃度、1∶40料液比、70 ℃提取溫度、1.5 h提取時間和40 min超聲輔助為最佳提取工藝，且此時黃芩中黃酮提取率最高為8.53%。同時，利用黃酮濃度與DPPH自由基清除率之間的關系圖直觀獲得了黃芩黃酮清除自由基的抗氧化性能，結果表明隨著濃度增加，黃酮抗自由基活性逐步提高。